Protocolli BioLab.5
Scheda N°3.1: DETERMINAZIONE DEL COD
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Il COD è la quantità di ossigeno necessaria per ossidare completamente tutte le sostenze organiche presenti nel campione. La determinazione del COD nel siero deve essere condotta sul campione diluito.
Principio del metodo
Il COD viene determinato ossidando le sostanze organiche all'ebollizione con dicromato di potassio in ambiente acido in presenza di solfato d'argento che serva a evitare l'ossidazione dello ione clorururo che interferisce sull'analisi, e in presenza di solfato di mercurio che agisce da catalizzatore. Il dicromato di potassio che non ha reagito viene titolato con lo ione ferro (II) in presenza di ferroina come indicatore.
Cr2O72− + 6 Fe2+ + 14 H+ → 2 Cr3+ + 6 Fe3+ + 7 H2O
Campionamento
Il prelievo del campione viene effettuato in bottiglie di polietilene. Il campione viene conservato in frigorifero e l’analisi deve essere iniziata entro 24 ore.
Reattivi
1) Solfato di mercurio (II) cristallizzato HgSO4
2) Soluzione di solfato di argento: disciogliere 0,1 g di Ag2SO4 in 100 mL di H2SO4 concentrato. Versare cautamente la soluzione in un matraccio da 1 L contenente mL di acqua distillata e, una volta raffreddato, portare a 1 L con acqua distillata
3) Soluzione di dicromato di potassio 0,25 N: disciogliere 12,259 g di K2Cr2O7 anidro e portare a 1 L in matraccio con acqua distillata.
4) Soluzione di Fe(II) (sale di Mohr) 0,25 N: disciogliere 98 g di (NH4)2Fe(SO4)2∙6H2O in 500 mL di acqua distillata, aggiungere 20 mL di H2SO4 concentrato e portare 1L in un matraccio con acqua distillata. Questa soluzione deve essere standardizzata utilizzando la soluzione di dicromato di potassio.
5) Soluzione di ferroina: disciogliere 1,485 g di o-fenantrolina e 0,695 g di solfato di ferro (II) esaidrato in acqua e portare a 100 mL.
Procedimento
1) Prelevare 10 mL di campione e diluirlo a 1000 mL in un matraccio con acqua distillata (diluizione 100 volte)
2) In un pallone da 250 mL porre 0,4 g di HgSO4 e 20 mL del campione diluito e agitare. Aggiungere 10 mL della soluzione di dicromato di potassio, collegare il refrigerante da riflusso e aggiungere attraverso quest'ultimo 30 mL della soluzione di solfato d' argento in acido solforico. Agitare e lasciare bollire 2 ore. Raffreddare a temperatura ambiente, lavare dall'alto il refrigerante con 50 mL di acqua distillata, togliere il refrigerante e diluire la soluzione con altri 50 mL di acqua distillata. Aggiungere 3 gocce di ferroina e titolare con la soluzione di sale di Mohr fino viraggio da verde a rosso bruno.
Ripetere l'intera operazione su 20 mL di acqua distillata come prova in bianco per eliminare le interferenze.
Espressione dei risultati
Il risultato viene espresso come mg/L di ossigeno
COD=mL0-mLcNFe∙1000∙8mLCampione100
dove mL0 e mLc rappresentano i mL di soluzione di Fe(II) utilizzato nella titolazione della prova in bianco e del campione rispettivamente e NFe è la normalità della soluzione di Fe(II) (Sale di Mohr)
Scheda N°3.2: DETERMINAZIONE DEL BOD
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Il BOD5 è la quantità di ossigeno necessaria ai microrganismi presenti in un corpo idrico per decomporre le sostanze organiche contenute in un litro di acqua. La determinazione del BOD5 è quindi un modo indiretto per misurare la quantità di materiale biodegradabile presente in un refluo. La determinazione del BOD5 nel siero deve essere condotta sul campione diluito.
Principio del metodo:
Il BOD5 viene calcolato come differenza tra l’ossigeno disciolto nel campione in esame esame prima e dopo incubazione per un periodo di cinque giorni, al buio e alla temperatura di 20°C, e viene espresso in mg/L di ossigeno. La determinazione dell’ossigeno disciolto è basata su una titolazione iodometrica secondo il metodo Winkler. Lo ione Mn2+ in soluzione alcalina è ossidato dall’ossigeno disciolto nel campione formando un precipitato di MnO(OH)2, in cui il manganese ha numero di ossidazione pari a +4, che trattato con un acido forte in presenza di ione ioduro, libera una quantità equivalente di iodio riducendosi di nuovo a Mn2+. Lo iodio liberato viene titolato con una soluzione di tiosolfato di sodio, dai mL di tiosolfato utilizzati per la titolazione si risale alla quantità di ossigeno disciolto nel campione.
O2 + 2 Mn2+ + 4 OH– → 2 MnO(OH)2
MnO(OH)2 + 4 H+ + 2 I– → Mn2+ + I2 + 3 H2O
I2 + 2S2O32– → 2I– + S4O62–
Campionamento
Il prelievo del campione viene effettuato in bottiglie di polietilene. Il campione viene conservato in frigorifero e l’analisi deve essere iniziata entro 24 ore.
Reattivi
1) Soluzione di solfato di manganese: sciogliere 36,4 g di MnSO4 in 100 mL di acqua distillata.
2) Soluzione alcalina di ioduro di potassio: sciogliere 7,5 g di KI e 25 g di NaOH in 50 mL di acqua distillata.
3) Soluzione di tiosolfato di sodio 0,0125 N: prelevare 62,5 mL di soluzione 0,1 N e portare a volume con acqua distillata in un matraccio da 100 mL.
4) Acido solforico concentrato
5) Salda d'amido preparata di fresco
Procedimento
1) Prelevare 10 mL di campione e diluirlo a 1000 mL in un matraccio con acqua distillata (diluizione 100 volte)
1) Trasferire circa 600 mL di campione diluito in un becher e sottoporli ad aerazione per 10 minuti, mantenendo la temperatura a 20°C.
2) Suddividere il campione in due bottiglie di incubazione (bottiglia di Winkler) con tappo a smeriglio.
3) Porre una delle due bottiglie in termostato a 20°C per 5 giorni, in completa oscurità.
4) Utilizzare l’altra bottiglia per la determinazione dell’ossigeno disciolto al tempo 0, secondo la seguente metodica:
Aggiungere sul fondo della bottiglia, con una pipetta, 2 mL di soluzione di solfato di manganese e 2 mL di soluzione alcalina di ioduro. Si osserva la formazione di un precipitato bruno dovuto alla reazione dello ione Mn2+ con l’ossigeno disciolto nell’acqua. Agitare bene e aspettare fino a decantazione completa del precipitato. Aggiungere 2 mL di acido solforico concentrato alla soluzione ed agitare. Si osserva la solubilizzazione del precipitato con formazione di colorazione bruna dovuta allo iodio prodotto. Prelevare 100 mL esatti della soluzione e titolare lo iodio liberatosi con tiosolfato di sodio 0,0125 N fino ad ottenere una colorazione giallo paglierino. Aggiungere 2 mL di salda d'amido. La soluzione assumerà colorazione blu. Continuare la titolazione fino alla completa decolorazione della soluzione.
5) Determinare l’ossigeno disciolto nel campione lasciato ad incubare 5 giorni, seguendo la metodica appena descritta.
Espressione dei risultati
La quantità di ossigeno disciolto, espressa in mg/L, viene determinata, sia al tempo 0 che dopo 5 giorni, applicando la seguente formula:
mg/LO2=mLTiosolfatoNTiosolfato10008mLCampione
Chiamando con A i mg/L di O2 al tempo 0 e con B i mg/L di O2 dopo 5 giorni e tenendo conto della diluizione del campione il BOD5 si calcola con la seguente espressione, e viene espresso in mg/L di O2:
BOD5=(A-B)100
Scheda N°3.3: DETERMINAZIONE DEL FOSFORO TOTALE
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Lo smaltimento del siero nell'ambiente apporta diverse sostanze inquinanti, tra cui il fosforo inorganico, presente come ione idrogenofosfato (HPO42−) e diidrogenofosfato (H2PO4−). La presenza di questi anioni inorganici nelle acque è correlata alle fioriture algali. Nella maggior parte delle acque il fosforo agisce infatti come fattore che limita la crescita dei vegetali perché, in genere, esso è presente in concentrazioni molto basse. Poiché le alghe richiedono solo piccole quantità di fosforo per vivere, un eccesso di fosforo può provocare una forte crescita algale, che può dare inizio a un fenomeno chiamato “eutrofizzazione”, che ha come risultato finale una drastica diminuzione della biodiversità nella comunità acquatica. Quando le alghe muoiono, infatti, i microrganismi aerobi iniziano la decomposizione della materia organica utilizzando buona parte dell’ossigeno disciolto nell’acqua. Questo provoca una forte diminuzione della quantità di ossigeno presente nello specchio d’acqua. In queste condizioni i microrganismi anaerobi subentrano, nella decomposizione della sostanza organica, a quelli aerobi sviluppando grandi quantità di sostanze tossiche e maleodoranti (ammoniaca, metano e acido solfidrico) che rendono l'ambiente inospitale per altre forme di vita.
Principio del metodo
La determinazione dei fosfati viene effettuata mediante spettrofotometria UV-visibile utilizzando il metodo della retta di taratura, previa derivatizzazione del campione. La reazione dello ione fosfato con il molibdato d’ammonio in ambiente acido e in presenza del catalizzatore antimonil tartrato porta alla formazione di un complesso fosfomolibdico che viene ridotto dall’acido ascorbico con formazione del blu di molibdeno, composto che assorbe ad una lunghezza d' onda di 704 nm. Il risultato dell’analisi è espresso in mg/L di fosforo (P).
Campionamento
Il siero di latte contiene da 200 a 500 mg/L di fosforo inorganico, l'analisi spettrofotometrica deve quindi essere condotta sul siero diluito di un fattore 103. Prelevare 1 mL di siero da analizzare e diluirlo a 1 L con acqua distillata in un matraccio tarato. La soluzione diluita viene utilizzata per l'analisi spettrofotometrica, il risultato finale deve tenere conto della diluizione.
Reattivi
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KH2PO4 (diidrogenofosfato di potassio) solido essiccato a 100°C per 2 ore
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Soluzione di molibdato di ammonio: sciogliere 9,5 g di eptamolibdato(VI) di esammonio tetraidrato [(NH4)6Mo7O24∙4H2O] in 100 mL di acqua.
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Soluzione di acido solforico 4,5 M: versare cautamente 250 mL di H2SO4 concentrato in un matraccio da 1 L contenete circa 600 mL di acqua; lasciare raffreddare e quindi portare a volume.
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Soluzione di potassio antimonil tartrato: sciogliere 3,25 g di potassio antimonil tartrato emiidrato [K(SbO)C4H4O6∙½H2O] in 100 mL di acqua scaldando se necessario.
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Soluzione di acido ascorbico: sciogliere 7 g di acido ascorbico in 100 mL di acqua.
Procedimento
1) Preparare una soluzione a 100 mg/L di fosforo partendo da KH2PO4 solido: pesare 0,439 g di KH2PO4 e portare a volume in un matraccio da 1 L.
2) Preparare una soluzione a 1 mg/L di fosforo: in un matraccio da 1 L sgocciolare 10 mL di soluzione a 100 mg/L e portare a volume.
3) Preparare del reagente misto: a 200 mL di acido solforico 4,5 M aggiungere 45 mL della soluzione di molibdato d’ammonio e 5 mL della soluzione di potassio antimonil tartrato.
4) Preparare le soluzioni standard di fosforo per la costruzione della retta di taratura.
Trasferire 1 – 2,5 – 5 – 10 – 25 mL della soluzione a 1 mg/L in 5 matracci da 50 mL in modo da ottenere 5 soluzioni standard rispettivamente a concentrazioni 0,02 – 0,05 – 0,1 – 0,2 – 0,5 mg/L.
Prima di portare a volume aggiungere in ogni matraccio 1,5 mL di reagente misto e 1,5 mL di acido ascorbico.
Preparare un bianco, trasferendo 1,5 mL di reagente misto e 1,5 mL di acido ascorbico in un matraccio da 50 mL.
Portare a volume soluzioni standard e bianco con acqua distillata.
Agitare bene e aspettare 5 minuti. Le soluzioni, tranne quella del bianco, si colorano in blu.
5) Misurare l'assorbanza delle soluzioni standard a λ=704 nm e costruire la retta di taratura.
6) Preparare i campioni di acqua da analizzare: porre circa 20 mL di acqua campione in matraccio da 50 mL, aggiungere 1,5 mL di reagente misto e 1,5 mL di acido ascorbico e portare a volume con l’acqua in esame. Aspettare 5 minuti.
7) Misurare l’assorbanza delle soluzioni campione a λ=704 nm.
8) Determinare la concentrazione espressa in mg/L di fosforo (P) del campione utilizzando la retta di taratura, la concentrazione del fosforo nel siero si ottiene moltiplicando per 1000 tale valore.
Scheda N°3.4: POLIMERIZZAZIONE DELL'ACIDO LATTICO PER DISTILLAZIONE AZEOTROPICA
Metodo
Preparare una soluzione di 20 g di acido lattico in 100 mL di xileni e distillare per 72 ore a 140 utilizzando l'apparecchiatura di Dean-Stark rimuovendo periodicamente l'acqua eliminata nel distillatore. A reazione avvenuta si rimuove il 90% del solvente per evaporazione attraverso l'apparecchiatura di Dean Stark, si raffredda e si aggiunge acqua distillata per provocare la precipitazione del polimero. Si filtra e si lava con acqua per eliminare gli oligomeri e si essicca per 24 ore a vuoto ottenendo il polimero sotto forma di polvere bianca. Pesare il prodotto e calcolare la resa della reazione tenendo conto che durante la polimerizzazione ogni molecole di acido lattico perde una molecole di acqua.
Il polimero di acido polilattico PLA ha un peso molecolare compreso tra 8000 e 10000 che corrisponde a un grado di polimerizzazione compreso tra 110 e 140.
Disciogliendo il polimero in diclorometano e lasciando evaporare la soluzione in un recipiente basso e largo si ottiene un film trasparente rigido di acido polilattico.