PROVE DI CONFERMA 1: IDENTIFICAZIONE CON COLORAZIONE GRAM

 

Mediante colorazione di Gram, si distinguono batteri che si colorano in violetto (Gram-positivi) e quelli che si decolorano con trattamento mediante acetone e alcool, preceduto dallo iodio, e che si colorano in rosa (Gram-negativi) dopo applicazione di un secondo colorante (fucsina o safranina). Le proprietà dei Gram-positivi di trattenere il violetto sembra legata alla diversa permeabilità della membrana cellulare. Alcuni Gram-positivi possono perdere la capacità di trattenere il colorante viola e appaiono, di conseguenza, colorati in rosa.

 

    Procedimento:

1. Lavorare sotto cappa a flusso laminare o in prossimità di un becco di Bunsen

2. Preparazione dello striscio: prelevare con un’ansa sterile una piccola porzione di una colonia ( oppure una goccia di sospensione microbica se il terreno è liquido) e porla al centro di un vetrino portaoggetti

3. Spandere delicatamente la goccia sul vetrino

4. Far asciugare il vetrino contenente lo striscio tenendolo in alto vicino alla fiamma del bunsen

5. Predisporre una vaschetta per la colorazione e appoggiare i vetrini su due vetrini o su una griglia

6. Versare con un contagocce la soluzione di cristalvioletto fino a coprire lo striscio

7. Lasciare a riposo per 1 minuto

8. Lavare con acqua distillata

9. Versare con un contagocce la soluzione di Lugol fino a coprire lo striscio

10. Lasciare a riposo per 1 minuto

11. Lavare con alcol

12. Versare con un contagocce la soluzione di safranina ( o fucsina basica) fino a coprire lo striscio

13. Lasciare a riposo per 1 minuto 

14. Lavare con acqua distillata

15. Asciugare il vetrino all’aria o delicatamente con carta assorbente

16. Aggiungere una goccia di olio per immersione e osservare al microscopio

 

I batteri che trattengono il cristalvioletto appaiono blu-viola (Gram-positivi), mentre quelli che perdono la prima colorazione diventano rosa (Gram-negativi). 

 

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

 

L’identificazione per via biochimica è il metodo più conveniente per riconoscere generi e specie. 

Sono state proposte molte procedure. Una delle più conosciute è quella di King-Weaver (1972), che prescrive:

• per i Gram-positivi, le reazioni di fermentazione del glucosio, catalasi, ossidasi, formazione di spore, mobilità;

• per i Gram-negativi, le reazioni di utilizzazione del glucosio, catalasi, ossidasi, mobilità, crescita su MacConkey Agar.

 

1. Prova dell’ossidasi: I batteri che posseggono l’enzima citocromo ossidasi, in presenza di ossigeno, ossidano il substrato contenuto nella striscia, incolore allo stato ridotto, con formazione di un composto colorato. Il test dell’ossidasi è particolarmente indicato per la caratterizzazione dei batteri Gram negativi.

Procedimento: 

• 1. Munirsi di piastre con le colture da sottoporre al test

• 2. Osservare se le colture sono pure e se vi è crescita sufficiente. 

• 3. Inumidire una porzione della striscia con 2 gocce di acqua distillata. 

• 4. Toccare una colonia con un ansa di plastica o con un bastoncino di vetro, sterili e strisciare sulla porzione di carta inumidita. 

LETTURA ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Esaminare l’area inoculata della striscia per lo sviluppo di una colorazione da blu a grigio-blu entro 30 secondi. Organismi ossidasi positivi: sviluppo di una colorazione da blu a grigio-blu entro 30 secondi. Organismi ossidasi negativi: nessuno sviluppo di colore entro 30 secondi.

 

• Prova della catalasi

Il test della catalasi (enzima che favorisce la scissione del perossido d’idrogeno in ossigeno e acqua) può essere fatto su vetrino (stemperando in una goccia di acqua ossigenata al 3% una piccola quantità di patina colturale e osservando la formazione di bolle di ossigeno) oppure in provetta (aggiungendo alcune gocce della soluzione di acqua ossigenata). Questa seconda possibilità evita la formazione di aerosol pericolosi con germi patogeni. L’aggiunta del reattivo impedisce comunque ulteriori trapianti.

 

• Prova della fermentazione del glucosio

 

L’utilizzazione del glucosio, per distinguere se avviene per fermentazione o per ossidazione esige una metodica particolare. Il terreno è un agar semisolido in alto strato di colore verde (Hugh-Leifson). 

• Si semina la patina colturale con l’ago, per infissione, in due provette. A una provetta si aggiungono 2 ml di olio di vaselina sterile, per creare l’anaerobiosi. 

• Dopo incubazione a 37 °C per 24 ore, un viraggio al giallo in entrambe le provette indica “fermentazione” (F), un viraggio nella sola provetta senza olio indica “ossidazione” (O), una crescita microbica senza viraggi indica negatività alla saccarolisi (-).

 

• Aesculin bile test: 

Test rapido per evidenziare l'idrolisi dell'esculina. È in confezione contenete 30 provette con terreno essiccato. Aesculin Bile Test contiene un terreno diagnostico selettivo per la determinazione degli streptococchi di gruppo D. Questi microrganismi crescono in presenza di sodio azide e sono in grado di idrolizzare l'esculina a glucosio ed aglicone 6-7 diidrossicumarina: l'aglicone reagisce con i sali di ferro nel terreno, conferendo una colorazione nera.

Procedimento 

•  Prelevare una confezione dal frigorifero, prendere una o più provette e lasciarle per alcuni minuti sul banco di lavoro fino a raggiungere la temperatura ambiente. 

• Aggiungere 0.3 mL di PHYSIOLOGICAL SOLUTION (cod. 20095) nelle provette. 

• Utilizzando un' ansa sterile sospendere una colonia batterica ben isolata nel terreno di coltura contenuto nella provetta. 

• Chiudere le provette ed incubare a 36 ± 1 °C per 18 ore, fino ad un massimo di 24 ore.

• Interpretare i risultati secondo la tabella

Colore del terreno AESCULIN BILE TEST

Nero -> Positivo 

Incolore ->  Negativo 
 

• Prova della presenza dell’enzima coagulasi

La prova evidenzia l’attività coagulante esercitata dagli stafilococchi potenzialmente patogeni sul plasma. Tale attività è dovuta ad almeno due fattori: coagulasi libera (enzima extracellulare) e coagulasi legata o clumping factor (antigene della parete cellulare).

L’enzima è presente nella maggior parte dei biotipi, appartenenti alla specie Staphylococcus aureus e in biotipi appartenenti alle specie St. intermedius e St. hyicus, opportunisti patogeni per gli animali ed è sempre assente nelle specie saprofite e commensali.

• Prelevare con un’ansa sterile una colonia cresciuta su Agar Nutritivo, stemperarla in Brodo Nutritivo  o in Infuso Cuore Cervello. Incubare a (36 ± 1) °C per (22 ÷ 26) ore.

• Dosare in una provetta sterile 0,5 mL di plasma EDTA o plasma citrato  e 0,5 mL della brodocoltura sviluppatasi in Brodo Nutritivo o in Infuso Cuore Cervello, utilizzando pipette sterili.

In alternativa, 

• emulsionare 2–4 colonie, cresciute su Agar Nutritivo, nella provetta contenente il plasma EDTA o citrato;

•  miscelare delicatamente ed incubare a (36 ± 1) °C, preferibilmente in bagno termostatato. 

• Durante le prime 4 ore d’incubazione, effettuare la lettura ogni ora, inclinando la provetta da un lato con cura e senza agitare. 

Nei due terzi o in tutto il mezzo colturale la presenza dell’enzima coagulasi è rivelata da un coagulo ben gelificato. Se la prova risulta negativa, incubare ancora la provetta e ripetere la lettura dopo altre (22 ÷ 26) ore.

Il test in provetta accerta sia la coagulasi libera sia la coagulasi legata.

• Prova per la ricerca della coagulasi legata

Prelevare con un’ansa sterile una colonia cresciuta su Agar Nutritivo, stemperarla in una goccia d’acqua su un vetrino portaoggetti. Miscelare la sospensione ottenuta con un’ansata di plasma EDTA o plasma citrato. Gli Stafilococchi positivi alla coagulasi legata producono ammassi macroscopici entro (5 ÷ 15) sec. Se un biotipo è positivo alla coagulasi legata è sicuramente positivo anche alla coagulasi libera, se è negativo alla coagulasi legata può essere sia negativo che positivo alla coagulasi libera; pertanto è necessario confermare la prova su vetrino con quella in provetta.

Il test è indicato come tecnica di screening in presenza di numerosi campioni.

http://old.iss.it/binary/aqua/cont/MET%20STAF_14aprile2005.1161351665.pdf