Protocolli Lab3

Protocolli BioLab.3

Scheda N°1.2_a: SOPRAVVIVENZA A PH ACIDO

Per determinare la tolleranza dei batteri lattici al pH acido, ciascun ceppo è inizialmente fatto crescere in MRS broth in provette in condizioni di microaerofilia o in anaerobiosi per 24 ore a 37 ° C;
Trascorse le 24 ore le cellule batteriche sono raccolte per centrifugazione (3500 rpm per 10 minuti) e lavate due volte in tampone fosfato salino (PBS), pH 7.2 e di nuovo centrifugate.
Un’aliquota di 0,5 mL di ciascuna coltura batterica è inoculata in 4,5 mL di brodo portato a pH 2.5 mediante aggiunta di HCl 5N. Concentrazione finale di 106 - 107 CFU/mL.
Parallelamente allestire opportuni controlli, inoculando i batteri in brodo fresco (pH 6.5).
Incubare i campioni a 37 °C.
Prelevare, in condizioni asettiche, al tempo 0, e dopo 1, 2 e 3 ore, un’aliquota (1mL) per ciascun ceppo.
Diluire serialmente (preparare 4 o 5 diluizioni) in tampone fosfato (PBS) e per ciascuna diluizione seminare su piastre di MRS agar 10 μL in duplicato.
Incubare le piastre per 24 ore a 37°C in condizioni di (microaerofilia o) anaerobiosi.
Procedere alla conta delle CFU/ml.
Tutti i dati sono espressi come media degli esperimenti indipendenti eseguiti in duplice copia.

Scheda N°1.2_b: SOPRAVVIVENZA IN PRESENZA DI SALI BILIARI

Per la valutazione della sopravvivenza in presenza di sali biliari, si procede analogamente a quanto descritto nella scheda N1 del BL3, incubando opportune sospensioni dei ceppi LAB in brodo addizionato con 0,3% di sali biliari.
Prelevare al tempo 0, e dopo 1, 2 e 4 ore di incubazione a 37°C, un’aliquota di campione
Diluire
Seminare su MRS agar per le conte vitali.

Crescita in presenza di sali biliari

La capacità di crescita in presenza di bile è determinata inoculando 200 μl di una coltura overnight di ogni ceppo in 20 ml di brodo senza e con 0,3% di sali biliari.
I ceppi sono quindi incubati a 37 °C in agitazione e la crescita monitorata misurando allo spettrofotometro l’assorbanza a 600 nm (A600nm) al tempo 0 e dopo 1, 2, 4, 8 e 24 ore di incubazione.
I dati di crescita batterica sono analizzati mediante regressione non lineare adottando l’equazione di Gompetz come modello per generare la curva che meglio descrive l’andamento dei dati sperimentali.

Dalle curve di crescita di ciascun ceppo è ricavato il tempo necessario per ottenere un valore di densità ottica a 600nm pari a 0.3 sia per i controlli negativi che per le colture supplementate con i sali biliari. La differenza di tempo tra le colture in sali biliari ed i controlli, espressa in minuti, è considerata come ritardo di crescita e quindi come risultato di una inibizione causata dalla presenza dei sali biliari. Gli esperimenti sono condotti in duplicato.

Scheda N°1.2_c: DETERMINAZIONE DEL PROFILO ANTIBIOTICO DI RESISTENZA

La suscettibilità dei batteri lattici agli antibiotici è determinata utilizzando il metodo della diffusione su dischetto (metodo di Kirby-Bauer) secondo le linee guida dell’NCCLS (2000), modificate utilizzando rispettivamente l’MRS e l’M17 per Lactobacillus e Streptococcus.

vengono preparate in soluzione fisiologica sterile opportune sospensioni batteriche e standardizzate portandole a 0.5 McFarland per Lattobacilli e 1 McFarland per Streptococchi.
Una volta standardizzato l’inoculo, si seminano le brodocolture mediante tampone rispettivamente su piastre contenete MRS, M17 e Mueller-Hinton agar.
Dopo aver fatto assorbire l’inoculo, sulla superficie delle piastre vengono deposti i dischetti di antibiotico servendosi di pinzette sterili da flambare sul bunsen ad ogni singolo utilizzo.
Le piastre sono incubate a 37 °C per 24 ore in microaerofilia.
trascorso il periodo di incubazione, vengono valutati gli eventuali aloni di inibizione misurando il diametro della zona intorno al dischetto che non mostra alcuna crescita.
I risultati sono stati interpretati secondo le linee guida dell’NCCLS (2000). La lettura del risultato consiste nella misurazione del diametro del’alone di inibizione formatosi attorno al dischetto. Considerando il gradiente di concentrazione formatosi (tende a diminuire in direzione centrifuga), la sensibilità del ceppo batterico alla molecola saggiata sarà diretta funzione del diametro misurato: S = k · d

Gli esperimenti sono condotti in duplicato.

Eseguire un controllo positivo: il ceppo di riferimento Enterococcus faecalis ATCC 29212 è impiegato come controllo positivo in ogni esperimento per monitorare gli effetti del terreno e della microaerofilia sull’attività degli antibiotici.

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Metodo per determinare la concentrazione dei batteri in una sospensione

Torbidimetria standard per confronto con il nefelometro di Mc Farland

La provetta chiamata 0,5 Mc Farland può essere ottenuta dal commercio, oppure preparata aggiungendo 0,5 ml di una soluzione di cloruro di bario (BaCl2 ·2H2O) all’1,175% in acqua distillata a 99,5 ml di acido solforico all’1%.

Questa preparazione, sigillata per evitare l’evaporazione, è conservabile al buio a temperatura ambiente per sei mesi e va agitata prima dell’uso.

Il confronto dello standard 0,5 Mc Farland con il campione va fatto in provette dello stesso calibro.

Torbidimetro di Mc Farland

Si prepara miscelando in proporzioni variabili bario cloruro e acido solforico, in modo da ottenere soluzioni di bario solfato a differente torbidità (vedi tabella).

Esempio di calcolo

Numero di provette risultate positive, inizialmente seminate con:

- omogenato di partenza (contenente 1 grammo di materiale/ml): 2 su 3 seminate

- diluizione 10-1 (0,1 grammi/ml) 1 su 3

- diluizione 10-2 (0,01 grammi/ml) 0 su 3

Confrontando sulla tabella dell’ MPN, ai numeri 2 - 1 - 0 corrispondono 1,5 germi per grammo

o ml di materiale.

Scheda N°1.2_d: QUANTIFICAZIONE DELLE BATTERIICINE MEDIANTE DETERMINAZIONE DELLA MINIMA CONCENTRAZIONE INIBENTE (MIC)

Attività antagonista dei ceppi LAB nei confronti di batteri alterativi per produzione di sostanze ad attività antimicrobica

Materiali e metodi

Ceppi batterici e condizioni di crescita

Sono utilizzati seguenti ceppi batterici alteranti:

Gram-positivi: Staphylococcus spp, Micrococcus sp., Enterococcus faecalis

Tutte le specie batteriche target sono conservate a -80 ° C in glicerolo al 20%.

I batteri sono fatti crescere overnight in brodo nutritivo a 37 ° C.

Rilevazione di attività antagonista.

Al fine di scegliere la migliore metodologia per la rilevazione dell'attività antibatterica di Lactobacillus per evitare il deterioramento degli alimenti e la presenza di microrganismi patogeni, sono considerati i seguenti metodi.

Agar spot test
Agar well diffusion (UN).

Eseguire in entrambi i casi un controllo negativo.

Agar spot test

Colture over nigth di Lactobacillus sono seminate sulla superficie delle piastre di agar (MRS) e incubate per 24 ore a 37 ° C per consentire lo sviluppo di colonie.
I ceppi indicatori sono inoculati in 10 ml di agar MRS (De Man, Rogosa e Share) e versato sul piatto su cui è stato coltivato il lattobacillo.
Dopo incubazione per 24 ore a 37 ° C le piastre sono controllate per misurare gli aloni di inibizione.

Sono considerati positivi i ceppi che hanno prodotto una zona d’inibizione attorno allo spot superiore a 0,5 mm

Agar well diffusion (UN).

La valutazione della presenza di composti inibitori secreti nel mezzo di crescita da parte dei ceppi positivi all’agar spot test, è stato condotto tramite la tecnica di diffusione in agar mediante pozzetto o Agar Well Diffusion.

Preparazione dei surnatanti

I ceppi di Lactobacillus positivi all’agar spot test, quindi selezionati come potenziali produttori di batteriocine sono coltivati over nigth.
Si centrifuga la sospensione batterica a 9000 rpm per 15 minuti a 4°C in modo da separare i microrganismi dal surnatante
Si filtra il surnatante attraverso un filtro in acetato di cellulosa a pori di 0,45 μm (Millipore).
Si riporta il pH dei surnatanti con NaOH 5M a valori uguali a quelli della matrice alimentare al momento dell’isolamento del ceppo batterico.
Le piastre di agar MRS sono inoculate con 0,5 ml di una coltura over nigth del ceppo indicatore.
Nel terreno agar si praticano dei pozzetti del diametro di circa 10 mm di diametro
Si collocano100 μL del surnatante in ciascun pozzetto.
Si mettono ad incubare le piastre per 24 ore alla temperatura ideale di crescita del target.
Al termine dell’incubazione si misurano gli aloni intorno ai pozzetti:

Sono stati considerati come positivi per la presenza di batteriocine quei surnatanti in cui l’attività inibitoria sulla crescita del microrganismo indicatore crea aloni di inibizione con un diametro > 2 mm sulla superficie della piastra.

Quantificazione dell’attività delle batteriocine mediante MIC

Questa prova è molto simile alla tecnica MIC (Minima Concentrazione Inibente) impiegata per individuare la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita "in vitro" di un microrganismo.

Si preparano le piastre con il target come per la tecnica dell’agar-spot
il surnatante da testare è sottoposto a diluizioni scalari e seminato disponendolo in senso orario sulla piastra con spot di 10 μL.

L’attività della batteriocina è espressa in AU (unità arbitrarie)/mL dove AU è il reciproco della massima diluizione che presenta attività inibente (diametro aloni > 2 mm).

Scheda N°1.2_e: ATTIVITA' ANTAGONISTA DEL CEPPI LAB NEI CONFRONTI DI BATTERI ALTERATIVI PER PRODUZIONE DI SOSTANZE AD ATTIVITA' ANTIMICROBICA

Procedimento

Ceppi batterici e condizioni di crescita

Sono utilizzati i seguenti ceppi batterici alteranti:

Gram-positivi: Staphylococcus spp, Micrococcus sp., Enterococcus faecalis

Tutte le specie batteriche target sono conservate a -80 ° C in glicerolo al 20%.

I batteri sono fatti crescere overnight in brodo nutritivo a 37 ° C.

Agar spot test
Agar well diffusion (UN).

Eseguire in entrambi i casi un controllo negativo.

Agar spot test

Colture over nigth di Lactobacillus sono seminate sulla superficie delle piastre di agar (MRS) e incubate per 24 ore a 37 ° C per consentire lo sviluppo di colonie.
I ceppi indicatori sono inoculati in 10 ml di agar MRS (De Man, Rogosa e Share) e versato sulla piastra su cui è stato coltivato il lattobacillo.
Dopo incubazione per 24 ore a 37 ° C le piastre sono controllate per misurare gli aloni di inibizione.

Sono considerati positivi i ceppi che hanno prodotto una zona d’inibizione attorno allo spot superiore a 0,5 mm

Agar well diffusion (UN).

Preparazione dei surnatanti

I ceppi di Lactobacillus positivi all’agar spot test, quindi selezionati come potenziali produttori di batteriocine sono coltivati over nigth.
Si centrifuga la sospensione batterica a 9000 rpm per 15 minuti a 4°C in modo da separare i microrganismi dal surnatante.
Si filtra il surnatante attraverso un filtro in acetato di cellulosa a pori di 0,45 μm (Millipore).
Si riporta il pH dei surnatanti con NaOH 5M a valori uguali a quelli della matrice alimentare al momento dell’isolamento del ceppo batterico.
Le piastre di agar MRS sono inoculate con 0,5 ml di una coltura over nigth del ceppo alterante.
Nel terreno agar si praticano dei pozzetti del diametro di circa 10 mm di diametro
Si collocano100 μL del surnatante in ciascun pozzetto.
Si mettono ad incubare le piastre per 24 ore alla temperatura ideale di crescita del target.
Al termine dell’incubazione si misurano gli aloni intorno ai pozzetti:

PROVE DI CONFERMA 1: IDENTIFICAZIONE CON COLORAZIONE GRAM

Mediante colorazione di Gram, si distinguono batteri che si colorano in violetto (Gram-positivi) e quelli che si decolorano con trattamento mediante acetone e alcool, preceduto dallo iodio, e che si colorano in rosa (Gram-negativi) dopo applicazione di un secondo colorante (fucsina o safranina). Le proprietà dei Gram-positivi di trattenere il violetto sembra legata alla diversa permeabilità della membrana cellulare. Alcuni Gram-positivi possono perdere la capacità di trattenere il colorante viola e appaiono, di conseguenza, colorati in rosa.

Procedimento:

Lavorare sotto cappa a flusso laminare o in prossimità di un becco di Bunsen
Preparazione dello striscio: prelevare con un’ansa sterile una piccola porzione di una colonia ( oppure una goccia di sospensione microbica se il terreno è liquido) e porla al centro di un vetrino portaoggetti
Spandere delicatamente la goccia sul vetrino
Far asciugare il vetrino contenente lo striscio tenendolo in alto vicino alla fiamma del bunsen
Predisporre una vaschetta per la colorazione e appoggiare i vetrini su due vetrini o su una griglia
Versare con un contagocce la soluzione di cristalvioletto fino a coprire lo striscio
Lasciare a riposo per 1 minuto
Lavare con acqua distillata
Versare con un contagocce la soluzione di Lugol fino a coprire lo striscio
Lasciare a riposo per 1 minuto
Lavare con alcol
Versare con un contagocce la soluzione di safranina ( o fucsina basica) fino a coprire lo striscio
Lasciare a riposo per 1 minuto
Lavare con acqua distillata
Asciugare il vetrino all’aria o delicatamente con carta assorbente
Aggiungere una goccia di olio per immersione e osservare al microscopio

I batteri che trattengono il cristalvioletto appaiono blu-viola (Gram-positivi), mentre quelli che perdono la prima colorazione diventano rosa (Gram-negativi).

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

L’identificazione per via biochimica è il metodo più conveniente per riconoscere generi e specie.

Sono state proposte molte procedure. Una delle più conosciute è quella di King-Weaver (1972), che prescrive:

per i Gram-positivi, le reazioni di fermentazione del glucosio, catalasi, ossidasi, formazione di spore, mobilità;
per i Gram-negativi, le reazioni di utilizzazione del glucosio, catalasi, ossidasi, mobilità, crescita su MacConkey Agar.

Prova dell’ossidasi: I batteri che posseggono l’enzima citocromo ossidasi, in presenza di ossigeno, ossidano il substrato contenuto nella striscia, incolore allo stato ridotto, con formazione di un composto colorato. Il test dell’ossidasi è particolarmente indicato per la caratterizzazione dei batteri Gram negativi.

Procedimento:

1. Munirsi di piastre con le colture da sottoporre al test
2. Osservare se le colture sono pure e se vi è crescita sufficiente.
3. Inumidire una porzione della striscia con 2 gocce di acqua distillata.
4. Toccare una colonia con un ansa di plastica o con un bastoncino di vetro, sterili e strisciare sulla porzione di carta inumidita.

LETTURA ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Esaminare l’area inoculata della striscia per lo sviluppo di una colorazione da blu a grigio-blu entro 30 secondi. Organismi ossidasi positivi: sviluppo di una colorazione da blu a grigio-blu entro 30 secondi. Organismi ossidasi negativi: nessuno sviluppo di colore entro 30 secondi.

Prova della catalasi

Il test della catalasi (enzima che favorisce la scissione del perossido d’idrogeno in ossigeno e acqua) può essere fatto su vetrino (stemperando in una goccia di acqua ossigenata al 3% una piccola quantità di patina colturale e osservando la formazione di bolle di ossigeno) oppure in provetta (aggiungendo alcune gocce della soluzione di acqua ossigenata). Questa seconda possibilità evita la formazione di aerosol pericolosi con germi patogeni. L’aggiunta del reattivo impedisce comunque ulteriori trapianti.

Prova della fermentazione del glucosio

L’utilizzazione del glucosio, per distinguere se avviene per fermentazione o per ossidazione esige una metodica particolare. Il terreno è un agar semisolido in alto strato di colore verde (Hugh-Leifson).

Si semina la patina colturale con l’ago, per infissione, in due provette. A una provetta si aggiungono 2 ml di olio di vaselina sterile, per creare l’anaerobiosi.
Dopo incubazione a 37 °C per 24 ore, un viraggio al giallo in entrambe le provette indica “fermentazione” (F), un viraggio nella sola provetta senza olio indica “ossidazione” (O), una crescita microbica senza viraggi indica negatività alla saccarolisi (-).

Aesculin bile test:

Test rapido per evidenziare l'idrolisi dell'esculina. È in confezione contenete 30 provette con terreno essiccato. Aesculin Bile Test contiene un terreno diagnostico selettivo per la determinazione degli streptococchi di gruppo D. Questi microrganismi crescono in presenza di sodio azide e sono in grado di idrolizzare l'esculina a glucosio ed aglicone 6-7 diidrossicumarina: l'aglicone reagisce con i sali di ferro nel terreno, conferendo una colorazione nera.

Procedimento

Prelevare una confezione dal frigorifero, prendere una o più provette e lasciarle per alcuni minuti sul banco di lavoro fino a raggiungere la temperatura ambiente.
Aggiungere 0.3 mL di PHYSIOLOGICAL SOLUTION (cod. 20095) nelle provette.
Utilizzando un' ansa sterile sospendere una colonia batterica ben isolata nel terreno di coltura contenuto nella provetta.
Chiudere le provette ed incubare a 36 ± 1 °C per 18 ore, fino ad un massimo di 24 ore.
Interpretare i risultati secondo la tabella

Colore del terreno AESCULIN BILE TEST

Nero -> Positivo

Incolore -> Negativo

Prova della presenza dell’enzima coagulasi

La prova evidenzia l’attività coagulante esercitata dagli stafilococchi potenzialmente patogeni sul plasma. Tale attività è dovuta ad almeno due fattori: coagulasi libera (enzima extracellulare) e coagulasi legata o clumping factor (antigene della parete cellulare).

L’enzima è presente nella maggior parte dei biotipi, appartenenti alla specie Staphylococcus aureus e in biotipi appartenenti alle specie St. intermedius e St. hyicus, opportunisti patogeni per gli animali ed è sempre assente nelle specie saprofite e commensali.

Prelevare con un’ansa sterile una colonia cresciuta su Agar Nutritivo, stemperarla in Brodo Nutritivo o in Infuso Cuore Cervello. Incubare a (36 ± 1) °C per (22 ÷ 26) ore.
Dosare in una provetta sterile 0,5 mL di plasma EDTA o plasma citrato e 0,5 mL della brodocoltura sviluppatasi in Brodo Nutritivo o in Infuso Cuore Cervello, utilizzando pipette sterili.

In alternativa,

emulsionare 2–4 colonie, cresciute su Agar Nutritivo, nella provetta contenente il plasma EDTA o citrato;
miscelare delicatamente ed incubare a (36 ± 1) °C, preferibilmente in bagno termostatato.
Durante le prime 4 ore d’incubazione, effettuare la lettura ogni ora, inclinando la provetta da un lato con cura e senza agitare.

Nei due terzi o in tutto il mezzo colturale la presenza dell’enzima coagulasi è rivelata da un coagulo ben gelificato. Se la prova risulta negativa, incubare ancora la provetta e ripetere la lettura dopo altre (22 ÷ 26) ore.

Il test in provetta accerta sia la coagulasi libera sia la coagulasi legata.

Prova per la ricerca della coagulasi legata

Prelevare con un’ansa sterile una colonia cresciuta su Agar Nutritivo, stemperarla in una goccia d’acqua su un vetrino portaoggetti. Miscelare la sospensione ottenuta con un’ansata di plasma EDTA o plasma citrato. Gli Stafilococchi positivi alla coagulasi legata producono ammassi macroscopici entro (5 ÷ 15) sec. Se un biotipo è positivo alla coagulasi legata è sicuramente positivo anche alla coagulasi libera, se è negativo alla coagulasi legata può essere sia negativo che positivo alla coagulasi libera; pertanto è necessario confermare la prova su vetrino con quella in provetta.

Il test è indicato come tecnica di screening in presenza di numerosi campioni.

http://old.iss.it/binary/aqua/cont/MET%20STAF_14aprile2005.1161351665.pdf

Prova di conferma 2: Caratterizzazione delle attività enzimatiche/fermentative mediante API system

I ceppi oggetto di studio saranno oggetto di caratterizzazione metabolica mediante gallerie API (bioMérieux, Marcy-l’Etoile, France:

sistema API50 CH per la caratterizzazione di lattobacilli
Sistema API20 Strep per la caratterizzazione di lattococchi.

Caratterizzazione di Lactobacillus spp. mediante API 50 CH

Il sistema API 50 CH è un kit standardizzato che consente, attraverso lo studio del metabolismo dei carboidrati da parte dei microrganismi testati, l’identificazione fenotipica di batteri quali Lactobacillus, Lactococcus e generi affini. Il kit è basato su 50 test biochimici ed è utilizzato in associazione con API 50 CHL Medium ed identifica i microrganismi tramite il risultato della fermentazione di 49 zuccheri. La fermentazione è evidenziata da una variazione di colore nella microprovetta (da blu a giallo), dovuta alla produzione di acido in anaerobiosi, rivelata dall’indicatore di pH contenuto nel mezzo utilizzato.

Preparazione delle gallerie e dell’inoculo

Preparare una postazione sotto cappa a flusso laminare
Preparare una scatola di incubazione (fornita dalla BioMérieux) dove allestirela galleria l’una che devono essere collocate nella vaschetta dopo aver distribuito sul fondo di questa 10 mL circa di acqua sterile
Contrassegnare ogni galleria con il numero della coltura in esame
Prelevare una aliquota da ogni coltura in esame e utilizzarla per allestire una sospensione molto densa in una delle provette contenenti 2 mL di APISuspension Medium
Trasferire un numero definito di gocce (n) della sospensione preparata al punto 4, fino ad ottenere una torbidità pari al punto 2 della scala di McFarland (corrispondente approssimativamente ad una concentrazione cellulare di 6 ∙ 108 UFC/mL
Inoculare una provetta contenente API50CHL Medium con un numero di gocce 2n della sospensione preparata al punto 4.
Distribuire la sospensione ottenuta al punto precedente in ognuno dei 50 pozzetti del kit API50CHL, utilizzando una pipetta Pasteur sterile, delicatamente avendo cura di riempire tutta la parte anaerobica (tubo), tenendo la vaschetta leggermente inclinata, in modo evitare la formazione di bolle all’interno delle provette stesse
Con l’aiuto di un’altra pipetta Pasteur, distribuire 50 μL di olio di paraffina sterile sopra a ciascuno dei pozzetti del kit API50CHL, in modo da riempire la cupola e creare condizioni di anaerobiosi nel microtubo.
Coprire con l’apposito coperchio
Incubare a 37°C per 48 ore
Verificare la presenza di un viraggio di colore nei pozzetti dopo 24 e 48 ore, e determinare il profilo di fermentazione delle differenti finti di carbonio annotandolo sull’apposita scheda allegata a kit
Per la definizione preliminare delle specie utilizzare le tabelle allegate al kit o collegarsi a:

https://apiweb.biomerieux.com/login

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Caratterizzazione di Lactococcus spp. mediante API20 Strep

Il sistema API20 Strep e un sistema standardizzato composto da 20 test biochimici ad elevata discriminazione. Permette di identificare a livello di gruppo o di specie la maggior parte degli streptococchi, degli enterococchi e degli altri germi piu comuni ad essi correlati (Leuconostoc spp, Lactococcus spp, Aerococcus spp. etc.).

La galleria API20 Strep e costituita da 20 microprovette contenenti substrati disidratati per la rivelazione delle attività enzimatiche o della fermentazione degli zuccheri.

Preparazione delle gallerie e dell’inoculo

Il kit API è provvisto di una vaschetta da incubazione e da un involucro sterile nel quale si trova

una striscia contenente le 20 microprovette.

Sulla base della vaschetta da incubazione vi sono degli alveoli nei quali viene distribuita acqua

distillata o demineralizzata, per impedire l’eccessivo essiccamento delle gallerie durante il periodo d’incubazione.

Sopra gli alveoli si sistemano le cinque strisce di gallerie, facendo attenzione a rispettare la numerazione delle microprovette. La vaschetta è inoltre dotata di una linguetta laterale sulla quale deve essere annotato il numero identificativo del ceppo testato.
I lattococchi in esame conservati a -80°C sono rivitalizzati mediante coltivazione in M17 agar. Una volta ottenuta la coltura fresca in terreno agarizzato, questa è raccolta con un tampone sterile ed inoculata all’interno di tubi contenenti 2 ml di acqua distillata sterile oppure Api Suspension Medium, fino a raggiungere una concentrazione corrispondente al punto 4 della scala di McFarland (corrispondente approssimativamente ad una concentrazione cellulare di 12 ∙108 UFC/ml).

Inoculo delle gallerie

Con il supporto di una pipetta sterile, la sospensione batterica si distribuisce nella prima metà delle microprovette della galleria (test da VP a ADH), tenendo la vaschetta leggermente inclinata, in modo da evitare la formazione di bolle all’interno delle provette stesse. Nella seconda metà delle microprovette (test da RIB a GLYG) si distribuisce invece una soluzione costituita da API GP Medium addizionato con 0,5 ml della soluzione batterica precedentemente preparata.

Le cupole dei test da ADH a GLYG vengono riempiti con olio di paraffina sterile fino a formare

un menisco convesso. In questo modo si vengono a creare le condizioni di anaerobiosi necessarie alla fermentazione dei carboidrati.

Le gallerie cosi preparate sono incubate a 30°C per 24 ore.

Risultati e interpretazione

Per alcuni dei compartimenti, si può semplicemente leggere il cambio di colore subito dopo 24 ore, ma per alcuni si deve mettere i reagenti prima di leggere.
Aggiungere i seguenti reagenti a questi scomparti specifici
1. TDA: una goccia di cloruro ferrico
2. IND: una goccia di reagente Kovacs
3. VP: una goccia del 40% di KOH (reagente VP 1) e una goccia di reagente VP 2 (α-naftolo) (aspettare 10 minuti prima di considerarlo negativo).
4. Si ottieni la scala di lettura dell'API (tabella dei colori)
5. Segnare ogni test come positivo o negativo sul coperchio del vassoio
6. I pozzetti sono contrassegnati in triplette da triangoli neri, per i quali i punteggi sono assegnati come segue:

Il profilo di questa combinazione di reazioni è quindi 7031645 (codice a 7 cifre)
Identificare l'organismo utilizzando il catalogo API o apiweb
VIDEO: lettura di un API20E utilizzando il database online

https://www.youtube.com/watch?v=PXIis18qN9k

Identificare l'organismo usando api web :

Avviare Internet Explorer o il browser Web Firefox
Collegarsi a: https://apiweb.biomerieux.com
Login: nome di accesso
Password: la password scelta
Selezionare il test corretto (ad es. API 20E).
Immettere il profilo numerico per ottenere l'identità.
Registrare l'identità insieme ai commenti (% ID e valore T) sul foglio dei risultati.