Protocolli Lab2

Protocolli BioLab.2

Scheda N°3.2_a: CARICA BATTERICA TOTALE

Procedimenti comuni alle preparazioni dei terreni

Preparazione del diluente

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Effettuare una prova di sterilità, incubando una aliquota di terreno in piastra Petri in stufa termostatata a 37°C.
Il terreno può essere preparato in precedenza e conservato in frigo a 4°C.
Al momento dell’utilizzo, scaldarlo nel forno a microonde fino a completa fusione e mantenerlo a 45°-48°in bagno termostatato.

DILUIZIONE DEL CAMPIONE

Latte crudo :

mescolare il campione di latte per inversione (almeno 25 volte)

Prelevare con una pipetta sterile 1 mL di latte e trasferirlo in una provetta contenente 9 mL di soluzione salina /peptone. La diluizione ottenuta è pari a 10-1
A partire dalla diluizione 10-1 preparare diluizioni da 10-3 a 10-5 sempre con lo stesso diluente

Latte pastorizzato

Procedere come descritto per latte crudo con diluizioni da 10-1 a 10-3

PROTOCOLLI:

DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA MESOFILA DEL LATTE CRUDO
DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA MESOFILA DEL LATTE PASTORIZZATO
DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA PSICROFILA DEL LATTE CRUDO
DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA PSICROFILA DEL LATTE PASTORIZZATO

DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA MESOFILA DEL LATTE CRUDO

TERRENO da utilizzare: TRYPTIC GLUCOSE YEAST AGAR (PLATE COUNT AGAR)

DESCRIZIONE del terreno: Tryptic Glucose Yeast Agar (Plate Count Agar) è consigliato da APHA, AOAC, ICMSF, ISO, dalle normative italiane ed europee per la conta totale dei batteri aerobi ed anaerobi facoltativi eterotrofi, nelle acque, nei liquami, negli alimenti, nel latte, nei prodotti lattiero caseari, nei cosmetici ed in generale in tutti i prodotti d’interesse igienistico. Il terreno è preparato con materie prime selezionate, rispondenti ai requisiti di USP, che garantiscono un eccellente riproducibilità di risultati tra lotti diversi di terreno.

PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE

Sospendere 23.5 g di polvere in 1000 mL di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. pH finale 7.0 ± 0.2.

SEMINA

1. Introdurre 1 mL di ciascuna diluizione, con le cautele dell’asepsi, nelle piastre Petri, in duplicato.

2. Versare nelle piastre 12-15 ml di Tryptic Glucose Yeast Agar (Plate Count Agar) termostatato a 44-47 °C. 3. Mescolare bene l’inoculo con il terreno, lasciar solidificare su piano orizzontale.

4. In caso si sospetti la presenza di microorganismi nel campione che possono crescere abbondantemente sulla superficie del terreno, versare sopra alle piastre solidificate un strato di terreno di 4 ml raffreddato a 44-47°C

5. Capovolgere le piastre ed incubare a 30°C per 72 ± 3 ore.

6. Contare le colonie coltivate nelle piastre in cui siano presenti da 15 a 300 colonie.

CONTEGGIO

Contare con il contacolonie le coppie di piastre nelle quali sono visibili colonie in numero da 30 a 300.
Calcolare la media dei due conteggi delle due piastre di una determinata diluizione e moltiplicare per il reciproco della diluizione
Calcolare la media dei due conteggi delle due piastre di una seconda diluizione e moltiplicare per il reciproco della diluizione stessa
Calcolare la media dei due risultati. Espresso in UFC/mL

Si può anche applicare la formula:

C(n1+0,1*n2)d

Dove:

C= somma del numero di colonie contate

(n1+ 0,1 x n2)d = volume di campione inoculato con:

n1= numero di piastre utilizzate per la prima diluizione

n2= numero di piastre utilizzate per la seconda diluizione

d= fattore di diluizione relativo alla diluizione del primo conteggio

DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA MESOFILA DEL LATTE PASTORIZZATO

Si ripete il procedimento descritto per il latte fresco, ma si seminano diluizione del campione da 10-2 a 10-3.

DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA PSICROFILA DEL LATTE CRUDO

PREINCUBAZIONE a 6° per 5 giorni. Al termine della preicubazione mescolare capovolgendo rapidamente per 25 volte il contenitore con il campione.

DILUIZIONE DEL CAMPIONE

Per la diluizione utilizzare la soluzione di Ringer 1:4 sterile. Procedere alle diluizioni da 10-1 a 10-?(da valutare in funzione della carica microbica attesa)

TERRENO da utilizzare: PLATE COUNT AGAR WITH SKIM MILK

Plate Count Agar with Skim Milk viene usato in microbiologia alimentare per la conta dei batteri aerobi nel latte in polvere e nei gelati, secondo gli standard della International Dairy Federation, ISO 6610, ISTISAN 96/35

PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE

Sospendere 24.5 g in 1000 ml di acqua distillata fredda. Riscaldare fino ad ebollizione mescolando fino a completa soluzione. Autoclavare a 121°C per 15 minuti. pH finale 7.0 ± 0.2 .

Effettuare una prova di sterilità

SEMINA

Raffreddare il terreno autoclavato a 48-50°C
trasferire 1 ml delle diluizioni decimali del campione in piastre Petri sterili.
Versare 15 ml del terreno sciolto e mescolare bene l’inoculo.
Lasciare solidificare su piano orizzontale
Incubare a 21° per 72

DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA PSICROFILA DEL LATTE PASTORIZZATO

PREINCUBAZIONE a 6°C per 5 giorni. Al termine della preicubazione mescolare capovolgendo rapidamente per 25 volte il contenitore con il campione.

DILUIZIONE DEL CAMPIONE

Per la diluizione utilizzare la soluzione di Ringer 1:4 sterile. Procedere alle diluizioni da 10-1 a 10-?(da valutare in funzione della carica microbica attesa)

TERRENO da utilizzare: Plate Count Agar with Skim Milk

PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE

Sospendere 24.5 g in 1000 ml di acqua distillata fredda. Riscaldare fino ad ebollizione mescolando fino a completa soluzione. Autoclavare a 121°C per 15 minuti. pH finale 7.0 ± 0.2 .

Effettuare una prova di sterilità.

SEMINA

1. Introdurre 1 mL di ciascuna diluizione, con le cautele dell’asepsi, nelle piastre Petri, in duplicato.

2. Versare nelle piastre 12-15 ml di Tryptic Glucose Yeast Agar (Plate Count Agar) addizionato di latte scremato e termostatato a 44-47 °C.

3. Mescolare bene l’inoculo con il terreno, lasciar solidificare su piano orizzontale.

5. Capovolgere le piastre ed incubare a 21° per 25 ore.

CONTEGGIO DELLE COLONIE: indicato precedentemente.

Scheda N°3.2_b: DETERMINAZIONE DEI COLIFORMI TOTALI NEL LATTE CRUDO E PASTORIZZATO

TERRENO da utilizzare: DESOXYCHOLATE LACTOSE AGAR

DESCRIZIONE del terreno: terreno selettivo per il conteggio dei batteri coliformi in acque, latte, prodotti lattiero-caseari e altri prodotti alimentari. Il terreno è utilizzato anche l’isolamento e la differenziazione degli enterobatteri da campioni biologici.

- I batteri Gram-positivi sono inibiti dal desossicolato, sebbene il citrato di sodio eserciti anch’esso una efficace azione selettiva.

- La differenziazione degli enterobatteri si basa sulla loro capacità di fermentare il lattosio:

i ceppi lattosio-positivi producono acidi che, in presenza di rosso neutro, inducono la formazione di colonie rosse;
i batteri lattosio-negativi (Salmonella o Shigella) formano colonie incolori.

PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE

Sospendere 42,5 g di terreno disidratato in 1 litro di acqua distillata o deionizzata. Portare lentamente a ebollizione, agitando fino a completa soluzione. Lasciare bollire per 2 minuti. Non autoclavare.

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

Diluzione del campione: per la diluizione utilizzare la soluzione di Ringer 1:4 sterile

latte fresco a 10-1 e 10-2
pastorizzato a 10-1

SEMINA

- Raffreddare e mantenere il terreno a 47°C.

- Trasferire 1 mL del prodotto in esame e le sue diluizioni seriali decimali (10-1 e 10-2) in piastre Petri sterili.

- Versare 12 mL di terreno.

- Omogeneizzare con movimenti circolari.

- Lasciare solidificare su una superficie fredda.

- Sovrapporre un secondo strato (4 mL) di terreno.

- Lasciare solidificare. - Incubare a 37°C per 24 ore.

RISULTATI

Le colonie caratteristiche presentano un colore rosso e un diametro pari o maggiore a 0,5 mm dopo 24 ore di incubazione

Conteggio delle colonie come indicato nella scheda BioLab 2 punto3.2_a

NUMERAZIONE DEI COLIFORMI NEL LATTE PASTORIZZATO

TERRENO da utilizzare: VIOLET RED BILE AGAR

DESCRIZIONE del terreno: Violet Red Bile Agar è un terreno selettivo e differenziale indicato per l’isolamento ed il conteggio dei coliformi negli alimenti, nel latte e nei prodotti lattiero-caseari. Il terreno è proposto da ICMSF e da APHA per la determinazione, con il metodo in piastra, dei coliformi negli alimenti. Violet Red Bile Agar contiene sali biliari n. 3 e cristalvioletto che inibiscono la crescita dei batteri Gram-positivi; il rosso neutro permette di distinguere i microrganismi lattosio fermentanti da quelli lattosio non fermentanti. La fermentazione del lattosio provoca un’acidificazione del mezzo con conseguente viraggio dell’indicatore verso il rosso-viola e la precipitazione dei sali biliari.

PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE: Sospendere 41.5 g di polvere in 1000 ml di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione; raffreddare in bagnomaria a circa 45°C e trasferire in piastre Petri inoculate. Dopo solidificazione addizionare uno strato di terreno di copertura per impedire la crescita microbica in superficie e lo sciamare delle colonie. L’autoclavatura non è necessaria. pH finale 7.4 ± 0.2.

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Il campione di latte va mescolato capovolgendo il contenitore per almeno 25 volte per assicurare l'omogenea distribuzione degli eventuali microrganismi.

DILUIZIONE : Diluzione del campione a 10-1, 10-2, 10-3 con la soluzione di Ringer 1:4 sterile

SEMINA

In asepsi, prelevare 3 ml di campione di latte con una pipetta sterile e depositare 1 mL di campione in ciascuna delle tre piastre sterili. Tra il passaggio 1 e il passaggio 3 non devono intercorrere più di 3'.
Sul campione versare 12 mL circa di VRBL Agar fuso e raffreddato a circa 45°C.
Mescolare il terreno colturale appena versato con il campione ruotando la piastra, per avere un’omogenea distribuzione delle colonie che si sviluppano.

Tra la fine delle preparazioni del campione e la miscelazione dall'aliquota di analisi con il terreno non devono trascorrere più di 15'.

Lasciare riposare le piastre su una superficie orizzontale pulita e fredda sino a quando il terreno non si sia solidificato.
A solidificazione avvenuta, versare circa 4 ml di VRBL sulla superficie del terreno inoculato; lasciar raffreddare.
Trasferire le piastre in termostato capovolte e impilate (non più di 6 per pila); incubare a 30°C per 24 ore.

RISULTATI

Sul terreno VRBL Agar, sono caratteristiche dei coliformi le colonie di colore rosso scuro con un diametro di circa 0,5 con o senza precipitato intorno. Si prendono in considerazione solo piastre contenenti non più di 150 colonie.

Se le colonie non hanno un aspetto caratteristico si procede con un saggio di conferma.

PROVA DI CONFERMA IN CAMPANULA DI DURHAM

Terreno di coltura: Brodo Bile Verde Brillante (BGLB).

Preparare una serie di tre triplette di tubi contenti 10 mL di terreno e la campanella di Durham.
Prelevare con un’ansa sterile le colonie sospette e allestire le diluizioni 10-1 , 10-2 ,10-3 con acqua peptonata.
Trasferire 1 mL di ciascuna sospensione in una serie di tre provette.
Incubare i tubi a 30° per 24 ore e 48 ore
Eseguire la lettura sia dopo 24 che dopo 48 ore.

RISULTATI

Si considerano positive quelle colonie che nel tubo di Durham producono gas.

CONTEGGIO DELLE COLONIE con il metodo MPN

si individuano i tubi positivi per ogni diluizione (presenza di torbidità, di gas, etc.)
utilizzando delle tabelle statistiche si determina, dalla combinazione di tubi positivi a partire dalle 3 ultime diluizioni cresciute, il numero più probabile di microrganismi
individuare la diluizione limite: è l’ultima diluizione, se esiste, con tutti i tubi positivi;
individuare il numero caratteristico: è un numero a 3 cifre sostituito dal numero di tubi positivi nella diluizione limite, dal numero di tubi positivi in quella successiva e poi ancora nella successiva;
ricavare dalle tabelle MPN il numero più probabile corrispondente al numero caratteristico;
moltiplicare per il fattore di diluizione corrispondente alla diluizione limite.

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Tabella valida nel caso in cui vengano seminate 3 provette per ciascuna diluizione, contenenti quantità di campione pari a 1, 0,1, 0,01 grammi (o ml).

Se nelle diluizioni sono state seminate quantità di campione pari a 0,1, 0,01, 0,001 grammi (o ml), i valori riportati nella colonna MPN vanno moltiplicati per 10.

Scheda N°3.2_c: NUMERAZIONE DELLE ENTEROBACTERIACAE TOTALI nel LATTE CRUDO.

TERRENO da utilizzare: VIOLET RED BILE GLUCOSE AGAR (VRBGA)

DESCRIZIONE del terreno: Violet Red Bile Glucose Agar. Il terreno presenta come carboidrato fermentabile il glucosio, per cui tutti gli enterobatteri crescono con colonie rosse con o senza alone di precipitazione dei sali biliari. Il terreno è inibitorio per i batteri Gram-positivi.

ISO descrive il terreno Violet Red Bile Glucose (VRBG) Agar nel metodo di ricerca degli enterobatteri con tecnica MPN e per la conta diretta in piastra con o senza pre-arricchimento.

Diluizione del campione: allestire le diluizioni del campione di latte crudo 10-1, 10-2, 10-3con soluzione di Ringer 1:4

PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE

Sospendere 41.5g in 1000 ml di acqua distillata fredda. Scaldare fino ad ebollizione sotto agitazione. Non autoclavare. Raffreddare a 45-50°C e distribuire in piastre sterili pH finale 7.4 ± 0.2

SEMINA Metodo del conteggio in piastra

Trasferire, in duplicato, in piastre sterili 1 ml di campione liquido, ed 1 ml delle diluizioni decimali successive del campione;
aggiungere 15 ml di VRBG Agar;
dopo solidificazione aggiungere un secondo strato di 15 ml di terreno, per rafforzare la fermentazione del glucosio. Lasciar solidificare;
incubare le piastre capovolte a 37°C per 24 ore.

RISULTATI:

Considerare come Enterobacteriaceae le colonie di diametro maggiore di 0,5 mm di colore rosso-viola con o senza alone rosso-viola. Selezionare 5 colonie tipiche per piastra ed eseguire la conferma biochimica: test dell’ossidasi e di fermentazione.

CONTEGGIO DELLE COLONIE

Calcolare la media dei due conteggi nelle piastre che presentano una crescita compresa tra 25 e 250 colonie. Moltiplicare per il fattore di diluizione.

PROVE DI CONFERMA

Prova dell’ossidasi: I batteri che posseggono l’enzima citocromo ossidasi, in presenza di ossigeno, ossidano il substrato contenuto nella striscia, incolore allo stato ridotto, con formazione di un composto colorato. Il test dell’ossidasi è particolarmente indicato per la caratterizzazione dei batteri Gram-negativi.

Procedimento:

1. Munirsi di piastre con le colture da sottoporre al test

2. Osservare se le colture sono pure e se vi è crescita sufficiente.

3. Inumidire una porzione della striscia con 2 gocce di acqua distillata.

4. Toccare una colonia con un’ansa di plastica o con un bastoncino di vetro, sterili e strisciare sulla porzione di carta inumidita.

LETTURA ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Esaminare l’area inoculata della striscia per lo sviluppo di una colorazione da blu a grigio-blu entro 30 secondi. Organismi ossidasi positivi: sviluppo di una colorazione da blu a grigio-blu entro 30 secondi.

Organismi ossidasi negativi: nessuno sviluppo di colore entro 30 secondi. Le Enterobacteriaceae sono ossidasi negative.

PROVE DI FERMENTAZIONE DEL GLUCOSIO

Può essere eseguita con il sistema miniaturizzato API 20 CHL. (v. scheda “API prova di conferma”)

Oppure:

Riscaldare per 10 minuti in acqua bollente 2 provette di terreno per eliminare l'ossigeno, raffreddare prima dell’uso.
Seminare verticalmente per infissione entrambe le provette con un filo dritto fino a circa 6 mm di profondità.
Incubare una provetta in aerobiosi e l’altra in anaerobiosi, oppure sigillare la superficie con uno strato di olio di paraffina liquida sterile per una profondità di circa 3 cm sopra il terreno per creare condizioni anaerobiche.
Impostare i controlli in contemporanea con il microrganismo in accertamento prova
Incubare a 35-C per non più di 48 ore.
Può essere richiesto un periodo più lungo d’incubazione per le specie a lenta crescita.
Esaminare giornalmente le provette per cambiamento di colore.

Interpretazione

un viraggio al giallo in entrambe le provette indica “fermentazione” (F), un viraggio nella sola provetta senza olio indica “ossidazione” (O), una crescita microbica senza viraggi indica negatività alla saccarolisi (-).

Scheda N°3.2_d: NUMERAZIONE DEI LATTOBACILLI MESOFILI E TERMOFILI

TERRENO da utilizzare: Man- Rogosa-Sharpe (MRS) agar acidificato a pH 5,4 con acido lattico (5 mol/L).

Tenere presente che non tutti i lattobacilli crescono su MRS agar acidificato e alcuni crescono lentamente, in questi casi è opportuno utilizzare l’MRS agar non acidificato.

DESCRIZIONE del terreno: è un terreno selettivo usato per l’isolamento e la coltivazione di Lactobacillus sp. da campioni clinici, alimenti e prodotti lattiero caseari in accordo con la norma ISO/FDIS 15214. Questo terreno consente, inoltre, lo sviluppo di quei Lattobacilli difficili da coltivare in altri terreni di coltura.

I Lattobacilli sono caratterizzati da colonie piccole, opache e bianche. Il terreno permette la crescita di tutti i Lattobacilli compresi quelli a crescita difficile (L. brevis e L. fermenti).

Diluizione del campione: Maximum recovery diluent (MRD).

Prelevare asetticamente un’opportuna quantità del campione da esaminare e diluirla in rapporto 1:10 (sospensione iniziale) in MRD.
Omogeneizzare opportunamente in stomacher.
Eseguire ulteriori diluizioni decimali con lo stesso diluente fino a quella ritenuta utile per un adeguato conteggio.

PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE

Sospendere 70,2 g di MRS Agar in 1000 mL di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto

agitazione, distribuire ed autoclavare a 121°C per 15 minuti. pH finale è 6,4 ± 0,2

SEMINA per inclusione

Inserire 1 mL del campione liquido ed 1 mL delle successive diluizioni decimali in piastre Petri e addizionare 10-15 mL di terreno.
In funzione del tipo di ricerca da eseguire incubare come segue:

lattobacilli termofili a 42°C per 48 ore;
lattobacilli mesofili a 35°C per 48 ore;

RISULTATI:

Le colonie coltivate su MRS Agar devono essere sottoposte alle prove biochimiche per l’identificazione dei lattobacilli

PROVE DI CONFERMA

colorazione Gram : risultato: Gram positivo
test della catalasi: negativo
test dell’ossidasi: negativo

v. scheda PROVE DI CONFERMA

NUMERAZIONE DEI LATTOCOCCHI MESOFILI E TERMOFILI

TERRENO da utilizzare: M 17 Agar

DESCRIZIONE del terreno: M 17 Agar viene usato per l’isolamento e l’enumerazione degli streptococchi lattici dallo yogurt, formaggio, composti base ed altri prodotti caseari. Il terreno è raccomandato da International Dairy Federation e dal Rapporto ISTISAN 96/35 per l’isolamento selettivo e la determinazione di S. thermophilus.

Diluizione del campione: Maximum recovery diluent (MRD).

Prelevare asetticamente un’opportuna quantità del campione da esaminare e diluirla in rapporto 1:10 (sospensione iniziale) in MRD.
Omogeneizzare opportunamente in stomacher.
Eseguire ulteriori diluizioni decimali con lo stesso diluente fino a quella ritenuta utile per un adeguato conteggio.

PREPARAZIONE DEL TERRENO IN POLVERE

Sospendere 55.2 g di M 17 Agar in 1000 ml di acqua distillata fredda.

Portare ad ebollizione sotto agitazione l’agar, scaldare fino a completa soluzione il brodo, distribuire e sterilizzare a 121°C per 15 minuti

SEMINA

Da ciascuna provetta pipettare 1 ml della diluizione e seminare in piastre Petri sterili, in duplicato.
Aggiungere 14 ml di M 17 Agar raffreddato a 48 ± 1°C ad ogni piastra. Mescolare e lasciar solidificare.
Incubare per 48 ore a 30°C. (mesofili)
Incubare per 48 ore a 44°C. (termofili)

RISULTATI

S. thermophilus cresce con colonie lenticolari valutabili anche dopo 18-24 ore; esse raggiungono un diametro di 1-2 mm alle 48 ore.

L. bulgaricus è inibito o coltiva con colonie molto piccole.

Numerazione delle colonie

In presenza di una popolazione mista (indicazione in etichetta di più specie), la conta delle colonie va effettuata sia prima che dopo l’identificazione della specie (test di conferma).

Per la numerazione presuntiva considerare separatamente tutte le colonie con caratteristiche

morfologiche simili.

Numerazione delle colonie prima dell’identificazione

Procedere al calcolo del numero (N) di microrganismi presenti nell’aliquota analizzata, calcolando la media ponderata tra le due diluizioni successive prese in considerazione, in base alla seguente formula:

N =CV x 1,1d

Dove:

ΣC è la somma delle colonie ottenute dalla conta delle piastre relative alle due diluizioni successive prese in considerazione, e di cui almeno una contiene 10 colonie;

V è il volume, espresso in millilitri, dell’inoculo seminato in ogni piastra;

d è la diluizione corrispondente alla prima diluizione considerata.

CONTEGGIO DELLE COLONIE: Contare le piastre che abbiano sviluppato più di 40 colonie ed esprimere i risultati tenendo presente il fattore di diluizione, come UFC/mL.

Identificazione presuntive delle colonie

Subcoltivare nello stesso terreno agarizzato utilizzato per il conteggio tutte le colonie selezionate. Effettuare in doppio ogni subcoltura in modo tale da poterne congelare una a -80 °C in microbank, e utilizzare l’altra per le ulteriori determinazioni analitiche (prove di conferma).

PROVE DI CONFERMA

colorazione Gram per verificare che siano cocci Gram positivi
test della catalasi (negativa)
test dell’ossidasi

Scheda N°3.2_d_bis: NUMERAZIONE DEGLI ENTEROCOCCHI

TERRENO da utilizzare : Rapid Enterococcus Agar (REA)

DESCRIZIONE del terreno: terreno cromogenico selettivo per conta diretta (senza conferma di colonie) di Enterococchi intestinali (Lancefield gruppo D) in acqua (metodo di filtrazione su membrana) e nei prodotti alimentari. Questo terreno consente il rilevamento e la conta di E. faecalis, E. faecium, E. durans e E. hirae, così come altre specie di Enterococcus e alcune specie del genere Streptococcus (S. bovis e S. equinus in particolare).

Preparazione del terreno: Sospendere 66,6 g di RE Agar in 1000 ml di acqua distillata fredda.

Portare ad ebollizione sotto agitazione l’agar, scaldare fino a completa soluzione il brodo, distribuire e sterilizzare a 121°C per 15 minuti. Raffreddare a 50° e distribuire in piastra.

SEMINA

Semina per inclusione in rapid Enterococcus agar (REA) incubato aerobicamente a 44°C per 48 ore.

RISULTATI:colonie di colore blu-verde

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PROVE DI CONFERMA

Le colonie sospette sono sottoposte ai test di conferma della catalasi (v. scheda prove di conferma) e dell‘idrolisi dell‘esculina.

AESCULIN BILE TEST: test rapido per evidenziare l'idrolisi dell'esculina. È in confezione contenete 30 provette con terreno essiccato. Aesculin Bile Test contiene un terreno diagnostico selettivo per la determinazione degli streptococchi di gruppo D. Questi microrganismi crescono in presenza di sodio azide e sono in grado di idrolizzare l'esculina a glucosio ed aglicone 6-7 diidrossicumarina: l'aglicone reagisce con i sali di ferro nel terreno, conferendo una colorazione nera.

Procedimento

Prelevare una confezione dal frigorifero, prendere una o più provette e lasciarle per alcuni minuti sul banco di lavoro fino a raggiungere la temperatura ambiente.
Aggiungere 0.3 mL di PHYSIOLOGICAL SOLUTION (cod. 20095) nelle provette.
Utilizzando un' ansa sterile sospendere una colonia batterica ben isolata nel terreno di coltura contenuto nella provetta.
Chiudere le provette ed incubare a 36 ± 1 °C per 18 ore, fino ad un massimo di 24 ore.
Interpretare i risultati secondo la tabella

Scheda N°3.2_e: NUMERAZIONE DI ESCHERICHIA COLI

TERRENO da utilizzare : Tryptone Bile X-GLUC (TBX) Agar

DESCRIZIONE del terreno: indicato per il conteggio di E.coli β-glucuronidasi positivo nei prodotti destinati al consumo umano o per l’alimentazione animale con incubazione a 44°C e con metodo di semina per inclusione o con metodo delle membrane filtranti e per la tecnica del MPM-Most Probable Number.

Tryptone Bile X-GLUC (TBX) Agar, è un terreno selettivo e cromogenico; l’azione selettiva è dovuta alla presenza dei sali biliari, inibitori per i batteri Gram positivi; l’azione differenziale è esplicata dal substrato cromogenico X-GLUC (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-glucuronide), l’idrolisi del quale, attraverso l’enzima β-glucuronidasi, dà luogo alla formazione di un pigmento blu-verde.

E. coli, tra gli enterobatteri, è una delle poche specie β-glucuronidasi positiva e quindi coltiva sul terreno con colonie blu.

Gli enterobatteri β-glucuronidasi negativi coltivano con colonie incolori.

Preparazione del terreno: Sospendere 35,6 g in 1000 mL di acqua distillata fredda. Portare ad ebollizione sotto agitazione fino a completa soluzione, quindi autoclavare a 121°C per 15 minuti. Raffreddare a 44-47°C e distribuire in piastre Petri sterili.

SEMINA

Preparare una serie di diluizioni del campione con acqua peptonata
Trasferire 1 mL di sospensione del campione e delle sue diluizioni decimali in piastre sterili, in duplicato.
Aggiungere 15 mL di terreno e agitare le piastre con movimenti circolari per mescolare bene il terreno con il campione e lasciar solidificare.
Capovolgere le piastre e incubare in termostato a 44° per 24 ore.
Numerare le colonie tipiche ed esprimere il risultato come UFC/mL.

RISULTATI: contare come E.coli β-glucuronidasi positivo le colonie blu nelle piastre in cui vi siano non più di 150 colonie tipiche e non più di 300 colonie totali (tipiche e non tipiche).

Scheda N°3.2_f: STAFILOCOCCHI COAGULASI NEGATIVI

TERRENO da utilizzare: BD MANNITOL SALT AGAR

È un terreno utilizzato per l'isolamento selettivo di stafilococchi e il rilevamento dello Staphylococcus aureus da campioni clinici

DESCRIZIONE del terreno:

L'agar salato al mannitolo è un preparato allestito per la differenziazione degli stafilococchi coagulasi-positivi (Staphylococcus aureus) da quelli coagulasi-negativi.

L'agar salato al mannitolo è utilizzato per l'isolamento degli stafilococchi da campioni clinici e cosmetici e nei test sui limiti microbici.

Contiene peptoni ed estratto di carne bovina, che forniscono i nutrienti essenziali. Una concentrazione di cloruro di sodio del 7,5% inibisce parzialmente o del tutto gli organismi batterici diversi dagli stafilococchi.

La fermentazione del mannitolo, rivelata da un cambiamento dell'indicatore rosso fenolo, agevola la differenziazione delle specie di stafilococco.

Gli stafilococchi coagulasi-positivi (Staphylococcus aureus) producono colonie gialle con terreno circostante dello stesso colore,
Gli stafilococchi coagulasi-negativi producono colonie rosse senza alcun mutamento cromatico dell'indicatore rosso fenolo

PROCEDIMENTO

DILUIZIONE DEL CAMPIONE: allestire diluizioni 10-1 e 10? con diluente

TERRENO IN PIASTRE

Conservare le piastre al buio a 2 – 8 °C nella confezione originaria fino a immediatamente prima dell'uso.

Semina per striscio.

Incubare le piastre a 37 ± 2 °C in atmosfera aerobica.

Esaminare le piastre a distanza di 18 - 24 e 48 ore per valutare il livello di crescita, le dimensioni delle colonie, la pigmentazione e la selettività.

Si osservano le seguenti reazioni

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PROVE DI CONFERMA 1: IDENTIFICAZIONE CON COLORAZIONE GRAM

Mediante colorazione di Gram, si distinguono batteri che si colorano in violetto (Gram-positivi) e quelli che si decolorano con trattamento mediante acetone e alcool, preceduto dallo iodio, e che si colorano in rosa (Gram-negativi) dopo applicazione di un secondo colorante (fucsina o safranina). Le proprietà dei Gram-positivi di trattenere il violetto sembra legata alla diversa permeabilità della membrana cellulare. Alcuni Gram-positivi possono perdere la capacità di trattenere il colorante viola e appaiono, di conseguenza, colorati in rosa.

Procedimento:

Lavorare sotto cappa a flusso laminare o in prossimità di un becco di Bunsen
Preparazione dello striscio: prelevare con un’ansa sterile una piccola porzione di una colonia ( oppure una goccia di sospensione microbica se il terreno è liquido) e porla al centro di un vetrino portaoggetti
Spandere delicatamente la goccia sul vetrino
Far asciugare il vetrino contenente lo striscio tenendolo in alto vicino alla fiamma del bunsen
Predisporre una vaschetta per la colorazione e appoggiare i vetrini su due vetrini o su una griglia
Versare con un contagocce la soluzione di cristalvioletto fino a coprire lo striscio
Lasciare a riposo per 1 minuto
Lavare con acqua distillata
Versare con un contagocce la soluzione di Lugol fino a coprire lo striscio
Lasciare a riposo per 1 minuto
Lavare con alcol
Versare con un contagocce la soluzione di safranina ( o fucsina basica) fino a coprire lo striscio
Lasciare a riposo per 1 minuto
Lavare con acqua distillata
Asciugare il vetrino all’aria o delicatamente con carta assorbente
Aggiungere una goccia di olio per immersione e osservare al microscopio

I batteri che trattengono il cristalvioletto appaiono blu-viola (Gram-positivi), mentre quelli che perdono la prima colorazione diventano rosa (Gram-negativi).

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

L’identificazione per via biochimica è il metodo più conveniente per riconoscere generi e specie.

Sono state proposte molte procedure. Una delle più conosciute è quella di King-Weaver (1972), che prescrive:

per i Gram-positivi, le reazioni di fermentazione del glucosio, catalasi, ossidasi, formazione di spore, mobilità;
per i Gram-negativi, le reazioni di utilizzazione del glucosio, catalasi, ossidasi, mobilità, crescita su MacConkey Agar.

Prova dell’ossidasi: I batteri che posseggono l’enzima citocromo ossidasi, in presenza di ossigeno, ossidano il substrato contenuto nella striscia, incolore allo stato ridotto, con formazione di un composto colorato. Il test dell’ossidasi è particolarmente indicato per la caratterizzazione dei batteri Gram negativi.

Procedimento:

1. Munirsi di piastre con le colture da sottoporre al test
2. Osservare se le colture sono pure e se vi è crescita sufficiente.
3. Inumidire una porzione della striscia con 2 gocce di acqua distillata.
4. Toccare una colonia con un ansa di plastica o con un bastoncino di vetro, sterili e strisciare sulla porzione di carta inumidita.

LETTURA ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Prova della catalasi

Il test della catalasi (enzima che favorisce la scissione del perossido d’idrogeno in ossigeno e acqua) può essere fatto su vetrino (stemperando in una goccia di acqua ossigenata al 3% una piccola quantità di patina colturale e osservando la formazione di bolle di ossigeno) oppure in provetta (aggiungendo alcune gocce della soluzione di acqua ossigenata). Questa seconda possibilità evita la formazione di aerosol pericolosi con germi patogeni. L’aggiunta del reattivo impedisce comunque ulteriori trapianti.

Prova della fermentazione del glucosio

L’utilizzazione del glucosio, per distinguere se avviene per fermentazione o per ossidazione esige una metodica particolare. Il terreno è un agar semisolido in alto strato di colore verde (Hugh-Leifson).

Si semina la patina colturale con l’ago, per infissione, in due provette. A una provetta si aggiungono 2 ml di olio di vaselina sterile, per creare l’anaerobiosi.
Dopo incubazione a 37 °C per 24 ore, un viraggio al giallo in entrambe le provette indica “fermentazione” (F), un viraggio nella sola provetta senza olio indica “ossidazione” (O), una crescita microbica senza viraggi indica negatività alla saccarolisi (-).

Aesculin bile test:

Test rapido per evidenziare l'idrolisi dell'esculina. È in confezione contenete 30 provette con terreno essiccato. Aesculin Bile Test contiene un terreno diagnostico selettivo per la determinazione degli streptococchi di gruppo D. Questi microrganismi crescono in presenza di sodio azide e sono in grado di idrolizzare l'esculina a glucosio ed aglicone 6-7 diidrossicumarina: l'aglicone reagisce con i sali di ferro nel terreno, conferendo una colorazione nera.

Procedimento

Prelevare una confezione dal frigorifero, prendere una o più provette e lasciarle per alcuni minuti sul banco di lavoro fino a raggiungere la temperatura ambiente.
Aggiungere 0.3 mL di PHYSIOLOGICAL SOLUTION (cod. 20095) nelle provette.
Utilizzando un' ansa sterile sospendere una colonia batterica ben isolata nel terreno di coltura contenuto nella provetta.
Chiudere le provette ed incubare a 36 ± 1 °C per 18 ore, fino ad un massimo di 24 ore.
Interpretare i risultati secondo la tabella

Colore del terreno AESCULIN BILE TEST

Nero -> Positivo

Incolore -> Negativo

Prova della presenza dell’enzima coagulasi

La prova evidenzia l’attività coagulante esercitata dagli stafilococchi potenzialmente patogeni sul plasma. Tale attività è dovuta ad almeno due fattori: coagulasi libera (enzima extracellulare) e coagulasi legata o clumping factor (antigene della parete cellulare).

L’enzima è presente nella maggior parte dei biotipi, appartenenti alla specie Staphylococcus aureus e in biotipi appartenenti alle specie St. intermedius e St. hyicus, opportunisti patogeni per gli animali ed è sempre assente nelle specie saprofite e commensali.

Prelevare con un’ansa sterile una colonia cresciuta su Agar Nutritivo, stemperarla in Brodo Nutritivo o in Infuso Cuore Cervello. Incubare a (36 ± 1) °C per (22 ÷ 26) ore.
Dosare in una provetta sterile 0,5 mL di plasma EDTA o plasma citrato e 0,5 mL della brodocoltura sviluppatasi in Brodo Nutritivo o in Infuso Cuore Cervello, utilizzando pipette sterili.

In alternativa,

emulsionare 2–4 colonie, cresciute su Agar Nutritivo, nella provetta contenente il plasma EDTA o citrato;
miscelare delicatamente ed incubare a (36 ± 1) °C, preferibilmente in bagno termostatato.
Durante le prime 4 ore d’incubazione, effettuare la lettura ogni ora, inclinando la provetta da un lato con cura e senza agitare.

Nei due terzi o in tutto il mezzo colturale la presenza dell’enzima coagulasi è rivelata da un coagulo ben gelificato. Se la prova risulta negativa, incubare ancora la provetta e ripetere la lettura dopo altre (22 ÷ 26) ore.

Il test in provetta accerta sia la coagulasi libera sia la coagulasi legata.

Prova per la ricerca della coagulasi legata

Prelevare con un’ansa sterile una colonia cresciuta su Agar Nutritivo, stemperarla in una goccia d’acqua su un vetrino portaoggetti. Miscelare la sospensione ottenuta con un’ansata di plasma EDTA o plasma citrato. Gli Stafilococchi positivi alla coagulasi legata producono ammassi macroscopici entro (5 ÷ 15) sec. Se un biotipo è positivo alla coagulasi legata è sicuramente positivo anche alla coagulasi libera, se è negativo alla coagulasi legata può essere sia negativo che positivo alla coagulasi libera; pertanto è necessario confermare la prova su vetrino con quella in provetta.

Il test è indicato come tecnica di screening in presenza di numerosi campioni.

http://old.iss.it/binary/aqua/cont/MET%20STAF_14aprile2005.1161351665.pdf

Prova di conferma 2: Caratterizzazione delle attività enzimatiche/fermentative mediante API system

I ceppi oggetto di studio saranno oggetto di caratterizzazione metabolica mediante gallerie API (bioMérieux, Marcy-l’Etoile, France:

sistema API50 CH per la caratterizzazione di lattobacilli
Sistema API20 Strep per la caratterizzazione di lattococchi.

Caratterizzazione di Lactobacillus spp. mediante API 50 CH

Il sistema API 50 CH è un kit standardizzato che consente, attraverso lo studio del metabolismo dei carboidrati da parte dei microrganismi testati, l’identificazione fenotipica di batteri quali Lactobacillus, Lactococcus e generi affini. Il kit è basato su 50 test biochimici ed è utilizzato in associazione con API 50 CHL Medium ed identifica i microrganismi tramite il risultato della fermentazione di 49 zuccheri. La fermentazione è evidenziata da una variazione di colore nella microprovetta (da blu a giallo), dovuta alla produzione di acido in anaerobiosi, rivelata dall’indicatore di pH contenuto nel mezzo utilizzato.

Preparazione delle gallerie e dell’inoculo

Preparare una postazione sotto cappa a flusso laminare
Preparare una scatola di incubazione (fornita dalla BioMérieux) dove allestirela galleria l’una che devono essere collocate nella vaschetta dopo aver distribuito sul fondo di questa 10 mL circa di acqua sterile
Contrassegnare ogni galleria con il numero della coltura in esame
Prelevare una aliquota da ogni coltura in esame e utilizzarla per allestire una sospensione molto densa in una delle provette contenenti 2 mL di APISuspension Medium
Trasferire un numero definito di gocce (n) della sospensione preparata al punto 4, fino ad ottenere una torbidità pari al punto 2 della scala di McFarland (corrispondente approssimativamente ad una concentrazione cellulare di 6 ∙ 108 UFC/mL
Inoculare una provetta contenente API50CHL Medium con un numero di gocce 2n della sospensione preparata al punto 4.
Distribuire la sospensione ottenuta al punto precedente in ognuno dei 50 pozzetti del kit API50CHL, utilizzando una pipetta Pasteur sterile, delicatamente avendo cura di riempire tutta la parte anaerobica (tubo), tenendo la vaschetta leggermente inclinata, in modo evitare la formazione di bolle all’interno delle provette stesse
Con l’aiuto di un’altra pipetta Pasteur, distribuire 50 μL di olio di paraffina sterile sopra a ciascuno dei pozzetti del kit API50CHL, in modo da riempire la cupola e creare condizioni di anaerobiosi nel microtubo.
Coprire con l’apposito coperchio
Incubare a 37°C per 48 ore
Verificare la presenza di un viraggio di colore nei pozzetti dopo 24 e 48 ore, e determinare il profilo di fermentazione delle differenti finti di carbonio annotandolo sull’apposita scheda allegata a kit
Per la definizione preliminare delle specie utilizzare le tabelle allegate al kit o collegarsi a:

https://apiweb.biomerieux.com/login

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Caratterizzazione di Lactococcus spp. mediante API20 Strep

Il sistema API20 Strep e un sistema standardizzato composto da 20 test biochimici ad elevata discriminazione. Permette di identificare a livello di gruppo o di specie la maggior parte degli streptococchi, degli enterococchi e degli altri germi piu comuni ad essi correlati (Leuconostoc spp, Lactococcus spp, Aerococcus spp. etc.).

La galleria API20 Strep e costituita da 20 microprovette contenenti substrati disidratati per la rivelazione delle attività enzimatiche o della fermentazione degli zuccheri.

Preparazione delle gallerie e dell’inoculo

Il kit API è provvisto di una vaschetta da incubazione e da un involucro sterile nel quale si trova

una striscia contenente le 20 microprovette.

Sulla base della vaschetta da incubazione vi sono degli alveoli nei quali viene distribuita acqua

distillata o demineralizzata, per impedire l’eccessivo essiccamento delle gallerie durante il periodo d’incubazione.

Sopra gli alveoli si sistemano le cinque strisce di gallerie, facendo attenzione a rispettare la numerazione delle microprovette. La vaschetta è inoltre dotata di una linguetta laterale sulla quale deve essere annotato il numero identificativo del ceppo testato.
I lattococchi in esame conservati a -80°C sono rivitalizzati mediante coltivazione in M17 agar. Una volta ottenuta la coltura fresca in terreno agarizzato, questa è raccolta con un tampone sterile ed inoculata all’interno di tubi contenenti 2 ml di acqua distillata sterile oppure Api Suspension Medium, fino a raggiungere una concentrazione corrispondente al punto 4 della scala di McFarland (corrispondente approssimativamente ad una concentrazione cellulare di 12 ∙108 UFC/ml).

Inoculo delle gallerie

Con il supporto di una pipetta sterile, la sospensione batterica si distribuisce nella prima metà delle microprovette della galleria (test da VP a ADH), tenendo la vaschetta leggermente inclinata, in modo da evitare la formazione di bolle all’interno delle provette stesse. Nella seconda metà delle microprovette (test da RIB a GLYG) si distribuisce invece una soluzione costituita da API GP Medium addizionato con 0,5 ml della soluzione batterica precedentemente preparata.

Le cupole dei test da ADH a GLYG vengono riempiti con olio di paraffina sterile fino a formare

un menisco convesso. In questo modo si vengono a creare le condizioni di anaerobiosi necessarie alla fermentazione dei carboidrati.

Le gallerie cosi preparate sono incubate a 30°C per 24 ore.

Risultati e interpretazione

Per alcuni dei compartimenti, si può semplicemente leggere il cambio di colore subito dopo 24 ore, ma per alcuni si deve mettere i reagenti prima di leggere.
Aggiungere i seguenti reagenti a questi scomparti specifici
1. TDA: una goccia di cloruro ferrico
2. IND: una goccia di reagente Kovacs
3. VP: una goccia del 40% di KOH (reagente VP 1) e una goccia di reagente VP 2 (α-naftolo) (aspettare 10 minuti prima di considerarlo negativo).
4. Si ottieni la scala di lettura dell'API (tabella dei colori)
5. Segnare ogni test come positivo o negativo sul coperchio del vassoio
6. I pozzetti sono contrassegnati in triplette da triangoli neri, per i quali i punteggi sono assegnati come segue:

Il profilo di questa combinazione di reazioni è quindi 7031645 (codice a 7 cifre)
Identificare l'organismo utilizzando il catalogo API o apiweb
VIDEO: lettura di un API20E utilizzando il database online

https://www.youtube.com/watch?v=PXIis18qN9k

Identificare l'organismo usando api web :

Avviare Internet Explorer o il browser Web Firefox
Collegarsi a: https://apiweb.biomerieux.com
Login: nome di accesso
Password: la password scelta
Selezionare il test corretto (ad es. API 20E).
Immettere il profilo numerico per ottenere l'identità.
Registrare l'identità insieme ai commenti (% ID e valore T) sul foglio dei risultati.