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 Protocolli BioLab.1

Scheda N°3.1_a: PESO SPECIFICO DEL LATTE

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Il peso specifico del latte a 15° C deve avere valori compresi fra 1,029 e 1,034 g/ml.

Tali valori risultano superiori in caso di latte scremato, inferiori in caso di latte annacquato. Per altro se la scrematura e l’annacquamento vengono effettuati sullo stesso prodotto, nell’ambito di un 10%, non si verificano variazioni del peso specifico. In tale circostanza sono le analisi del peso specifico del siero, della % di materia grassa e dell’indice crioscopico a rivelare la sofisticazione.

Per la determinazione si utilizza uno speciale areometro, il LATTODENSIMETRO DI QUEVENNE, un’asta di vetro contenente ad un’estremità della zavorra ed all’altra estremità una scala graduata in 29 tacche, comprese tra 14 e 42: le due cifre indicano la seconda e la terza decimale, quindi si deve anteporre ad esse 1,0. Lo strumento incorpora un termometro ed è tarato a 15°C.

 

Principio del metodo

Il peso specifico del latte è in relazione sia alle sostanze in soluzione ed in sospensione (acqua e residuo magro) sia alle sostanze in emulsione (grassi). La determinazione è basata sul Principio di Archimede: un corpo galleggiante (areometro) si immerge nel latte fino a quando il peso del liquido spostato equivale al peso dell’areometro.

 

Apparecchiatura

  • Lattodensimetro di Quevenne

  • Cilindro da 300 ml

 

Procedimento

  • Mescolare il latte per renderlo omogeneo capovolgendo o agitando il contenitore

  • Versarlo lungo le pareti del cilindro fino a circa 10 cm dal bordo, evitando la formazione di schiuma

  • Introdurre con cautela il lattodensimetro, senza farlo aderire alle pareti

  • Dopo circa 1 minuto leggere il numero che risulta all’affioramento dell’asta graduata del lattodensimetro (se si legge per esempio 31, significa che il peso specifico del latte è 1,031)

  • Leggere la temperatura del latte sul termometro incorporato: se questa è diversa da 15°C, ma comunque compresa tra 10 e 20 °C, occorre effettuare un calcolo correttivo che consiste nell’aggiungere o togliere al valore letto 0,0002 per ogni grado di temperatura rispettivamente superiore o inferiore a 15°C.

CALCOLO CORRETTIVO: ps 15°C = pst° + 0,0002 ( t - 15 )


 

DETERMINAZIONE DEL PESO SPECIFICO DEL SIERO

Il peso specifico del siero del latte a 15° C deve avere valori compresi fra 1,026 e 1,028 g/ ml.

Il peso specifico del siero, non contenendo quest’ultimo proteine e grassi, allontanati dal latte tramite coagulazione, può variare entro limiti più ristretti.

 

Apparecchiatura

  • Lattodensimetro di Quevenne

  • Filtro

  • Imbuto

  • Becher

  • Cilindro da 300 ml

  • Pipetta da 2 ml

 

Reagenti

Soluzione di cloruro di calcio CaCl2 con densità 1,1375 a 15 °C (preparata sciogliendo 20 g di cloruro di calcio in 100 ml di acqua)

 

Procedimento

PREPARAZIONE DEL SIERO SECONDO ACKERMANN

  • Introdurre nel cilindro 240 ml di latte e 2 ml di soluzione di cloruro di calcio

  • Scaldare il tutto a bagnomaria bollente per 15 minuti con lo scopo di far coagulare la caseina

  • Raffreddare e filtrare con filtro a pieghe per separare la caseina ed ottenere il siero limpido

  • Determinare il peso specifico come per il latte utilizzando il lattodensimetro. La temperatura di riferimento è sempre 15°C. Analogo è il calcolo per la correzione della temperatura.

 

Il siero può essere preparato anche facendo coagulare 200 – 250 ml di latte con 3 – 4 ml di acido acetico al 20% (d = 1,028) e poi riscaldando a 45°C per 10 minuti.

In questo caso il peso specifico può arrivare a 1,029 g/ ml.

Scheda N°3.1_b: DETERMINAZIONE DELL’ACIDITÀ TITOLABILE E DEL PH

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Riferimento bibliografico 

Martelli e Frattini, 1985

 

Principi del metodo 

Il pH del latte fresco è compreso tra 6,4 e 6,6; quando scende sotto 6,45 in genere iniziata la fermentazione, che può considerarsi avanzata con valore di 6,1. L’acidità del latte fresco è quindi molto debole con un valore medio di 0,15- 0,16% (in genere compreso tra 0,10 e 0,22%) espresso come acido lattico. Essa è determinata fondamentalmente dalla caseina e dai fosfati, ma in piccola misura vi contribuiscono anche sieroproteine, citrati e anidride carbonica. Quando i fermenti lattici trasformano il lattosio in acido lattico, l’acidità ovviamente aumenta rapidamente. Dunque la sua determinazione dà un’indicazione dello stato di conservazione del latte. Il controllo dell’acidità è anche importante per il latte destinato al caseificio (se eccessiva sia difficoltà nella lavorazione del formaggio) oltre che per quello destinato ad uso diretto alimentare (se acido, per riscaldamento coagula).

 

Campo di applicazione 

La metodica è utilizzabile per la valutazione di latte liquido, o di latte in polvere previa ricostruzione con acqua distillata.

 

Procedura della determinazione

  • Si misura il pH del latte al pHmetro.

  • Si prelevano, con una buretta, 50 mL di latte che, posti in una beuta, vengono addizionati di 2 mL di soluzione alcolica di fenolftaleina.

  • Si titola con una soluzione di idrossido di sodio 0,25 N fino a colorazione rosea persistente.

 

Espressione dei risultati

Il numero di mL necessari a neutralizzare 100 mL di latte costituisce il grado di acidità (espressi in gradi S.H.). Per l’espressione dei risultati come meq o come g di acido lattico si applicano le seguenti formule: 

- acidità espressa come meq per 100 g di prodotto = V*(0,1/p)*100

- acidità espressa come g di acido lattico per cento grammi di prodotto= V*0,9/p

dove:

- V= mL di NaOH 0,1 N utilizzati nella titolazione;

- 0,9= fattore di conversione per l’acido lattico;

- p= peso in grammi del campione di latte utilizzato per la titolazione (da calcolare con il valore del peso specifico)

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Interpretazione dei risultati

Per un latte buono l’acidità totale compreso tra 7 e 8 °S.H. e, in genere, non è mai inferiore a 6,5 e superiore a 8 °S.H.. Valori compresi tra 2 e 4 °S.H. sono indice di latte proveniente da mammelle malate. Valori superiori a 9 °S.H. possono essere indice di latte colostrale, mentre il latte che coagula all’ebollizione ha valori superiori a 11 e quello che coagula spontaneamente superiori a 26. In Francia e paesi francofoni si usano i gradi Dornic, ottenibili moltiplicando i g di acido lattico/L per 10, ovvero direttamente dal volume di titolante necessario per neutralizzare 100 mL di latte, utilizzando come base a concentrazione N/9.

Scheda N°3.1_c: CONDUCIBILITA’ ELETTRICA DEL LATTE

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Principio del metodo

Il latte, dato il suo contenuto in elettroliti minerali (cloruri, fosfati, citrati) e ioni colloidali, permette il passaggio della corrente elettrica ed è caratterizzato da una certa conducibilità elettrica. La conducibilità del latte di misura in mho (o siemens, S, corrispondenti all’inverso di ohm/cm) e varia con la temperatura. A 25o C il valore medio del latte varia da 40*10-4 a 50*10-4 mho. 

Alcune alterazioni e stati patologici possono influire sulla conducibilità elettrica del latte. l'annacquamento abbassa la conducibilità (l’acqua ha una conducibilità più bassa, pari a 0,5*10-6 mho), mentre l’acidificazione la aumenta. Anche gli agenti antisettici e i conservanti aumentano la conducibilità. Il latte scremato ha una conducibilità maggiore del 10% rispetto al latte intero, in quanto il grasso pone resistenza al passaggio della corrente elettrica. Inoltre, si è osservato che quando il numero dei leucociti supera i 500.000 per ml. esiste una relazione positiva tra il numero di cellule somatiche e la conducibilità.

La conducibilità elettrica del latte è un parametro in grado di evidenziare anche infezioni alla mammella, in quanto rileva l’alterazione della composizione ionica del latte a causa dell’insorgenza di mastiti o, più in generale, di uno stato patologico a livello mammario. Aumentano, in particolare, le concentrazioni degli ioni cloro e sodio, responsabili dell’aumento della conducibilità elettrica; i latti patologici mostrano, infatti, una conducibilità elettrica spesso superiore a 50*10-4 mho. 

La misura di conducibilità è, quindi, un parametro utile non solo per la ricerca dell’annacquamento del latte, ma anche per il rilevamento di latti mastitici, ad esempio, i regolamenti svizzeri proibiscono la vendita di latte che possieda una conduttività superiore a 60*10-4 mho a 25o C.

 

Campo di applicazione 

 Applicabile al latte crudo, anche per determinazioni in stalla con i conduttivimetri portatili, e comunque a latti liquidi.

 

Procedura della determinazione 

Le misure di conducibilità elettrica possono essere eseguite mediante opportune apparecchiature (conduttimetri o conduttivimetri), che riportano direttamente sul display il valore di conducibilità, generalmente espressa in μS o mS. I conduttimetri possono essere da banco o anche portatili. Esistono anche strumenti multiparametro in grado di determinare contemporaneamente pH e conducibilità elettrica.

 

Espressione dei risultati

Tradizionalmente i risultati vengono espressi in mho; attualmente l’unità di misura impiegata dal sistema internazionale è il siemens (S).

 

Interpretazione dei risultati

Sono considerati nella norma valori di conducibilità elettrica a 25o C compresi tra 40 e 50*10-4 mho. Seppure in modo indicativo, valori > 60*10-4 mho sono da considerarsi indice di uno stato di anormalità del latte. Valori inferiori alla norma possono, invece, indicare annacquamento del latte.

Scheda N°3.1_d; TEST DELLA PEROSSIDASI

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Riferimento bibliografico 

Decreto ministeriale (Ministero della Sanità) del 26/3/1992, in Suppl. Ord. 67 alla Gazzetta Ufficiale 90 del 16/04/1992.

 

Principio del metodo

L’ebollizione porta all’inattivazione degli enzimi presenti nel latte crudo, tra i quali la perossidasi, enzima in grado di attivare l’acqua ossigenata rendendo possibili fenomeni di ossidazione che quest’ultima da sola non può compiere.

L’enzima perossidasico decompone il perossido di idrogeno. L’ossigeno atomico liberato ossida l’1,4-fenilenediammina che è incolore trasformandola in indofenolo di colore rosso porpora (test di Storch). L’intensità del colore è proporzionale alla concentrazione dell’enzima.

 

Campo di applicazione

Metodo applicabile a latte liquido, importante per la valutazione del latte pastorizzato.

 

Procedura della determinazione

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Reattivi

  • Soluzione di 1,4-fenilenediammina (C6H8N2) 0,18 M

Sciogliere in acqua calda a 50°C 2 g di 1,4-fenilendiammina (C6H8N2) e portare a 100 ml. Versare la soluzione in una bottiglia scura chiusa con un tappo di vetro e conservarla al fresco e al riparo dalla luce. Uno o due giorni dopo la preparazione della soluzione si forma un deposito e la soluzione non è più utilizzabile.

  • Soluzione di perossido di idrogeno

Diluire con acqua 9 mL di perossido di idrogeno al 30% (v/v) e portare a 100 mL. Per stabilizzare aggiungere 1 mL di acido solforico concentrato per litro di soluzione.

La soluzione di perossido di idrogeno è stabile per un mese se viene tenuta al fresco e al riparo dalla luce in una bottiglia con tappo di vetro evitando qualsiasi contatto con composti organici.

 

Procedimento

  • Introdurre 5 mL del campione di latte in una provetta pulita munita di chiusura adeguata.

  • Aggiungere 5 mL della soluzione di 1,4-fenilenediammina.

  • Aggiungere 2 gocce di soluzione di perossido di idrogeno.

  • Controllare la colorazione nei 30 secondi che seguono la miscelazione. Se la colorazione azzurra si ottiene oltre il tempo di 30 secondi dopo l’addizione dei reagenti, la reazione non è specifica.

 

Interpretazione dei risultati

La ricerca della perossidasi serve a stabilire se il latte è stato bollito o per lo meno sottoposto a sterilizzazione o bonifica a temperatura comunque superiore a 80°C. Lo sviluppo di una colorazione azzurra entro 30 secondi indica la positività del test.

Il valore positivo dell’attività perossidasica (enzima lattoperossidasi) conferma che l’abbattimento della carica microbica realizzato con il trattamento termico della pastorizzazione è stato ottenuto utilizzando temperature inferiori a 76°C per 15 sec e comunque non superando gli 80°C, temperatura oltre la quale l’enzima viene disattivato (prova negativa).

Scheda N°3.1_e: TEST DELLA FOSFATASI

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Riferimento bibliografico 

Decreto ministeriale (Ministero della Sanità) del 26/3/1992, in Suppl. Ord. 67 alla Gazzetta Ufficiale 90 del 16/04/1992.

 

Principio del metodo

Per il controllo dell’avvenuta pastorizzazione e della sua buona conduzione tecnica, si ricorre al saggio della fosfatasi, un enzima che catalizza la scissione dell’acido fosforico degli esteri organici e che è denaturato a temperature superiori a 60°C. Il latte ben pastorizzato dà negativa la prova della fosfatasi, la cui assenza assicura perciò che la pastorizzazione è stata fatta ad una temperatura sufficiente a distruggere i microrganismi patogeni. Essendo molto sensibile il saggio rivela mescolanze con latte crudo fino a percentuali molto basse.

L’attività fosfatasica è determinata dalla quantità di fenolo liberata dal fenifosfato disodico addizionato al campione. Il fenolo liberato reagisce con la dibromochinoneclorimide dando il dibromoindofenolo (di colore azzurrognolo) che viene determinato spettrofotometricamente a 610 nm (metodo di Sanders e Sager). Si effettua un confronto con un campione in cui la fosfatasi è stata precedentemente distrutta.

 L’attività fosfatasica è una misura della quantità di fosfatasi alcalina attiva presente nel prodotto ed è espressa come microgrammi di fenolo liberati da 1 mL di latte pastorizzato, alle condizioni specificate nel metodo.

 

Campo di applicazione

Metodo applicabile a latte liquido, in particolare adatto al latte pastorizzato.

 

Procedura della determinazione

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Reattivi

  • Tampone borato/idrossido di bario: 500 mL [Ba(OH)2·8H2O] 0,16 M e 500 mL di acido borico (H3BO3) 0,36 M sono scaldati a 50°C e miscelati. Il pH è portato a 10,6. Dopo filtrazione, conservare la soluzione in un recipiente ermeticamente chiuso.

Prima dell’uso, diluire la soluzione con uguale volume di acqua.

Tampone per lo sviluppo del colore: Metaborato sodico (NaBO2) 0,06 M e cloruro di sodio (NaCl) 0,34 M.

    Prima dell’uso 10 mL del tampone sono siluiti a 100 mL con acqua.

  • Soluzione di 2,6-dibromochinoneclorimide (soluzione BQC): Sciogliere 40,1 mg di 2,6-dibromochinoneclorimide (BQC) (C6H2Br2CNO6) in 10 mL di etanolo al 96% (v/v). Conservare in firgorifero in bottiglia di colore scuro, Il reattivo va buttato se cambia colore o se è stato preparato da più di un mese.

  • Substrato: Sciogliere 0,1 g di fenilfosfato disodico, disidratato esente da fenolo, in 100 mL di tampone borato/idrossido di bario oppure sciogliere 0,5 g di fenilfosfato disodico in 4,5 mL di soluzione tampone per lo sviluppo del colore. Aggiungere due gocce di soluzione BQC e lasciare in riposo a temperatura ambiente per trenta minuti. Estrarre il colore così formatosi con 2,5 mL di nutan-1-olo. Lasciare risposare fino alla separazione del butanolo e scartare la fase organica. Ripetere, se necessario, l’estrazione.

 

La soluzione può essere conservata in frigorifero per qualche giorno; prima dell’uso sviluppare il colore ed estrarre di nuovo. Preparare il 

substrato tamponato subito prima dell’uso diluendo 1 mL di questa soluzione con la soluzione tampone borato/idrossido di bario fino a volume di 100 mL.

 

  • Precipitante al rame-zinco: Solfato di zinco (ZnSO4) 10 mM e solfato rameico (CuSO4) 2,3 mM.

  • Soluzione di solfato rameico (II): Solfato ramico (II) (CuSO4) 2 mM.

  • Soluzione standard di fenolo: Pesare 200 mg di fenolo puro anidro e portare con acqua a 100 mL in un matraccio tarato mescolando. Questa soluzione madre può essere conservata per diversi mesi in frigorifero.

 

Diluire 10 mL della soluzione madre a 100 mL con acqua e mescolare. 1 mL contiene 200 µg di fenolo.

 

Saggio

È bene evitare, nel corso della determinazione, l’esposizione diretta alla luce solare. Devono essere evitate tracce di saliva o di sudore che possono dare risultati falsamente positivi.

 

  • Preparazione della curva di taratura

A partire dalla soluzione standard di fenolo, preparare una serie appropriata di soluzioni standard diluite contenenti 0 (bianco), 2, 5, 10 e 20 mg/mL e prelevare rispettivamente 1 mL di acqua e 1 mL delle quattro soluzioni standard di fenolo in ciascuna delle cinque provette.

Aggiungere a ciascuna provetta 1 mL della soluzione di solfato rameico (II), 5 mL del tampone del colore diluito, 3 mL di acqua e 0,1 mL della soluzione BQC; mescolare.

Lasciare sviluppare il colore per 30 minuti a temperatura ambiente.

Misurare l’assorbanza rispetto al bianco nello spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 610 nm. A partire dai valori di assorbanza ottenuti per ciascuna quantità di fenolo addizionata, calcolare la retta di regressione con il metodo dei minimi quadrati.

 

  • Preparazione del campione da analizzare

Effettuare l’analisi subito dopo il campionamento. In caso contrario conservare il campione in frigorifero, me per non più di 2 giorni.

Pipettare in due provette 1 mL del campione da analizzare, usando una provetta come controllo.

 

Determinazione

  • Scaldare la provetta del controllo per 2 minuti in acqua bollente; coprire la provetta e il becher contenente l’acqua bollente con un foglio di alluminio, per essere certi che tutta la provetta venga scaldata. Raffreddare rapidamente fino a temperatura ambiente.

  • Aggiungere 10 mL di substrato tamponato in entrambe le provette e mescolare.

  • Porre subito in incubazione nel bagnomaria per 1 ora, mescolando di tanto in tanto (almeno 4 volte) il contenuto della provetta.

  • Scaldare in acqua bollente per 2 minuti. Raffreddare quindi rapidamente fino a temperatura ambiente.

  • Aggiungere 1 mL del precipitante rame-zinco a ciascuna provetta e mescolare accuratamente.

  • Filtrare su carta da filtro asciutta, scartare i primi 2 mL e, se necessario, filtrare di nuovo sino ad ottenere un filtrato limpido; raccogliere 5 mL di filtrato in una provetta.

  • Aggiungere 5 mL di tampone per lo sviluppo del colore.

  • Addizionare 0,1 mL della soluzione BQC, mescolare e lasciare sviluppare la colorazione per 30 minuti a temperatura ambiente.

  • Misurare l’assorbanza rispetto al controllo alla lunghezza d’onda di 610 nm.

  • Se l’assorbanza misurata è superiore a quella della soluzione standard contenente 20 mg di fenolo per provetta, ripetere la determinazione diluendo opportunamente il campione.

  • Preparare tale diluizione mescolando 1 volume del campione in esame con un appropriato volume di una aliquota dello stesso campione portata con precauzione all’ebollizione per inattivare la fosfatasi.

 

Espressione dei risultati

Calcolare l’attività fosfatasica, espressa in µg di fenolo per mL di latte pastorizzato, con la seguente formula:

Atiività fosfatasica=2,4*A*D

dove:

A è la quantità di fenolo in µg ottenuta mediante interpolazione con la retta di taratura; D è il fattore di diluizione (in assenza di diluizione, D=1).

Il fattore 2,4 è il fattore di luizione che tiene conto dell’aggiunta del tampone e della soluzione precipitante. 

 

Interpretazione dei risultati

L’attività fosfatasica di un latte si considera negativa se risulta inferiore a 4 µg/mL.

Scheda N° 3.2_f: PROTEINE TOTALI (AZOTO TOTALE, METODO KJELDAHL) 

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Principi del metodo

Per la determinazione dell’azoto totale si segue il metodo classico di Kjeldahl. Esso si basa sulla mineralizzazione dell’azoto dell’alimento, cioè sulla sua trasformazione in ammoniaca per riscaldamento della sostanza organica con acido solforico concentrato, sulla distillazione in ambiente alcalino dell’ammoniaca stessa e sul suo dosamento acidimetrico. 

 

Campo di applicazione

Il metodo è applicabile a qualsiasi tipologia di latte.

 

Procedura della determinazione

È possibile utilizzare un’apparecchiatura da mineralizzazione seguendo la procedura descritta:

  • Si pongono in un tubo di mineralizzazione alcuni granelli di pomice;

  • Si aggiungono 2 mL di latte esattamente misurati;

  • Si versano 8 mL di acido solforico concentrato al 97-98% (p/p);

  • Si aggiungono 2 mL di perossido di idrogeno al 30% 8v/v);

  • Si addiziona al tutto una pastiglia di catalizzatore per Kjeldhal;

  • Si pone il tubo nell’apparecchiatura di mineralizzazione alla temperatura massima di circa 400 °C. questo processo richiede circa 1 ora, comunque si consiglia di verificare che la soluzione risulti limpida;

  • Si lascia raffreddare, quindi si diluisce con 30 mL di acqua esente da ammoniaca, facendo attenzione in quanto la reazione è esotermica.

Per effettuare la distillazione si può utilizzare un apparecchio di distillazione in corrente di vapore specifico per Kjeldahl, tramite il quale si aggiungono circa 50 mL di sodio di idrossido al 50%. Il distillato (circa 200 mL) è raccolto in una beuta contenente 25 mL di acido solforico 0,1 N per salificare l’ammoniaca. 

L’eccesso di acid solforico viene titolato con idrossido si sodio 0,1 N, utilizzando un indicatore schermato (rosso di metile 0,2 g e blu di metilene 0,1 g in 100 mL di metanolo) con viraggio dal viola al verde. 

 

Espressione dei risultati

La percentuale di N totale si ottiene con la seguente relazione: 

 

%N tot = 14,01 x (X – Y) x 0,1 x (100/Z)

 

X= mL di H2SO4 0,1 N usati per la raccolta del distillato;

Y = mL di NaOH 0,1 N usati nella distillazione;

Z = peso in milligrammi di latte ( da calcolare conoscendo il valore della densità). 

 

La percentuale di proteine si ricava moltiplicando la percentuale di N totale per il fattore di connessione tipico della proteine dei prodotti lattiero-caseari pari a 6,38.

% proteine = N tot x 6,38

 

Interpretazione dei risultati

I dati devono presentare una ripetibilità inferiore a 0,05 g di proteine totali su 100 g di prodotto. 

Scheda N°3.2_g: ELETTROFORESI DELLE PROTEINE

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Determinazione delle frazioni proteiche del siero tramite elettroforesi SDS-PAGE

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Riferimento bibliografico

Laemmli, 1970; Barile, 2007.

 

Principi del metodo

Le sieroproteine del latte vengono separate dalle caseine tramite acidificazione delle caseine al loro punto isoelettrico. Dal siero residuale le sieroproteine sono precipitate in presenza di acido tricloroacetico; il pellet ottenuto, opportunamente solubilizzato con un "sample buffer" contenente SDS, viene sottoposto ad elettroforesi. La separazione in SDS-PAGE si basa sulla migrazione differedziale delle sieroproteine in base al loro peso molecolare.

 

Campo di applicazione

Latte, latte in polvere, siero di latte da produzioni casearie.

 

Procedura della determinazione

Preparazione dei campioni

  • Partendo da latte: diluire 10 mL di latte con 10 mL di acqua distillata in matraccio tarato da 25 mL.

  • Riscaldare a 37 °C, aggiungere 1 mL di acido acetico al 5% (v/v) e agitare. Dopo 10 minuti aggiungere 1 mL di una soluzione di acetato di sodio 1 N, raffreddare e portare a volume con acqua distillata. Filtrare su carta e prelevare 1mL di filtrato.

  • Partendo da siero di latte, utilizzare direttamente 1 mL di siero.

 

Precipitazione delle sieroproteine

  • Si pone l’aliquota di campione in un tubo da centrifuga da 1,5 mi, e si addizionano 200 µL di soluzione di acido tricloroacetico al 100% (p/v) raffreddata a -20 °C.

  • I tubi sono posti in freezer per circa 20 minuti per favorire la precipitazione delle proteine.

  • Si centrifuga per 20 minuti a 14000 rpm da una temperatura di 4 °C.

  • Il surnatante viene eliminato e si procede al lavaggio del precipitato con acetone (raffreddato a -20 °C). Il lavaggio prevede l’aggiunta di 200 µL di acetone, una rapida agitazione su vortex e una centrifugazione di 10 minuti, alle condizioni precedentemente indicate. Si ripete l’operazione di lavaggio per tre volte, scartando ogni volta il surnatante.

  • Si pongono i tubi aperti a 37 °C in modo da evaporare l’acetone residuo.

  • Si recupera il precipitato con 50 µL di sample buffer, ottenendo quindi una concentrazione del campione di partenza di 20 volte.

  • Si denatura il campione ponendo i tubi da centrifuga per 3 minuti in bagnomaria all’ebollizione.

 

Elettroforesi SDS-PAGE

Preparazione della soluzione di TRIS HCl 1,5 M pH 8,8

  • Si sciolgono 18,15 g di TRIS (triidrossimetilaminometano) in circa 50 mL di acqua; quindi si porta la soluzione a pH 8,8 con acido cloridrico 2M e, infine, al volume di 100 mL. La soluzione deve essere conservata alla temperatura di 4 °C.

 

Preparazione della soluzione di TRIS HCl 0,5 M pH 6,8

  • Si sciolgono 6,0 g di TRIS in circa 50 mL di acqua; quindi si porta la soluzione a pH 6,8 con acido cloridrico 2M e, infine, al volume di 100 mL. La soluzione deve essere conservata alla temperatura di 4 °C.

 

Preparazione della soluzione di sample buffer

  • Si miscelano 4,2 mL di TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8, 0,8 mL di glicerolo, 1,6 mL di SDS al 10% (p/v) (ad es. 5 g in 50 mL di acqua), 500 µL di 2-mercaptoetanolo e una punta di spatola di bromofenolo.

 

Preparazione del gel

Le operazioni descritte e i volumi indicati si applicano in particolare ad un sistema di elettroforesi verticale con gel da 10 cm (ad es. MiniProtean 3, BioRad Laboratories, Segrate, MI)

  • Predisporre i vetrini per le operazioni di colatura del gel.

  • Preparare la soluzione di running gel secondo quanto indicato in Tabella 18.1. Dopo l’aggiunta di APS e TEMED, agitare su vortex la soluzione e colarla rapidamente tra i vetrini fino a circa 2 cm dal limite superiore.

  • Stratificare 0,5 mL di acqua distillata e attendere la polimerizzazione del gel.

  • A polimerizzazione avvenuta, rimuovere l’acqua in eccesso, aiutandosi con carta da filtro.

  • Preparare la soluzione di stacking gel come da Tabella 18.1 e, non appena aggiunti APS e TEMED, stratificare sul running gel, inserendo l’apposito pettine per la formazione dei pozzetti di caricamento.

In alternativa è possibile utilizzare gel precast disponibili commercialmente a differenti concentrazioni di acrilamide o gel a gradiente di concentrazione di acrilamide.

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Acrilamide: soluzione commerciale al 30 % (p/v) (acrilamide 28,8%; bisacrilamide 1,2%)

APS: ammonio persolfato soluzione acquosa al 10 % (p/v)

TEMED: N, N, N’, N’ tetrametiletilendiammina

 

Condizioni di corsa

  • Predisporre la cella elettroforetica secondo le istruzioni del produttore e versare il running buffer (3 g di TRIS, 14 g di glicina e 1 g di SDS in 1 L di acqua)

  • Rimuovere il pettine dallo stacking gel e procedere con il caricamento dei campioni (8 µL di soluzione in sample buffer). Caricare inoltre un opportuno volume di proteine standard a PM noto. 

  • Si esegue l'elettroforesi a 100 V finché i campioni non escono dallo stacking gel e successivamente si prosegue la corsa a 150 V, finché il colorante non esce dal gel.  

 

Colorazione al Blue Coomassie 

  • Si colora il gel per 1 ora in una soluzione acquosa al 40% di metanolo, 10% di acido acetico, 0,1% di Blue Coomassie R-250. 

  • Si decolora il gel con una soluzione acquosa al 20% di metanolo, 5% di acido acetico in più lavaggi per 1-3 ore. In alternativa si può decolorare tutta la notte nella soluzione di decolorante. I gel possono essere conservati in acido acetico al 5%. 

 

Espressione dei risultati 

Si consiglia di valutare i profili elettroforetici con l'ausilio di un transilluminatore, con un densitometro o con un analizzatore di immagine. 

Basandosi sulla separazione dei pesi molecolari (PM.) degli standard, è possibile ottenere il calcolo dei P.M. delle proteine separate. 

Per tutte le bande rivelate si determinano i valori di intensità di banda e/o i valori di percentuale relativa nell'ambito di ogni campione. 

 

Interpretazione dei risultati 

In Figura 18.3 è riportato un esempio di separazione di sieroproteine ottenuta nelle condizioni indicate, con le identificazioni delle principali bande.

I dati numerici ottenibili dall'integrazione densitometrica delle bande si prestano eventualmente ad una elaborazione statistica di tipo multivariato.

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Scheda N°3.3_h: GRASSI (BUTIRROMETRO GERBER)

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Principi del metodo (Gerber)

Il metodo che si usa più comunemente per la determinazione del grasso del latte è quello di Gerber che richiede l’impiego dell’omonimo acidobutirrometro. Esso si basa sulla separazione del grasso del latte per trattamento con una miscela di acido solforico concentrato e alcol isoamilico. L’acido prima coagula e poi scioglie le proteine e, agendo da disidratante, carbonizza parzialmente le stesse sostanze proteiche e gli zuccheri, dando una soluzione colorata in bruno. Il grasso, invece, rimane inalterato e indisciolto e può così essere dosato, previa centrifugazione. 

Il butirrometro di Gerber è uno speciale tubo di vetro con una estremità chiusa e l’altra munita di tappo di gomma. La parte stretta (chiusa) è graduata in modo che ogni divisione corrisponda a 0.10% di grasso nel latte. La determinazione si fa misurandone quindi direttamente il volume. 

 

Campo di applicazione 

E’ applicabile a campioni di latte liquido di qualsiasi tipologia.

 

Procedura della determinazione

La prova viene eseguita in doppio usando due butirrometri, in ciascuno dei quali si introducono, per mezzo di una pietra graduata, 10 ml di acido solforico, specifico per determinazione di Gerber con densità pari a 1,82 a 15° (90-91% p/p), avendo cura di non bagnare le pareti interne, e 11ml di di latte prelevati con l’apposita pipetta, curando che esso si stratifichi sull’acido senza mescolarsi. Subito dopo si aggiunge 1 ml di alcol isoamilico (densità 0,815-0,818 g/mL; punto di ebollizione 124-130 °C). I butirrometri vengono chiusi con gli appositi tappi di gomma e sottoposti ad agitazione. Si ha forte riscaldamento e colorazione della miscela in bruno. Se la colorazione fosse viola ciò sarebbe indizio di presenza di formaldeide aggiunta come conservante (aggiunta vietata dalla legge). 

I butirrometri vengono quindi posti nell’apposita centrifuga (previamente riscaldata) con la parte graduata rivolta verso l’alto. Dopo 2 minuti di centrifugazione si legge direttamente sulla parte graduata la percentuale di grasso. 

 

Espressione dei risultati 

Si effettua la lettura sulla scala graduata, il risultato è espresso direttamente come g di lipide su 100 mL di latte.

 

Interpretazione dei risultati

I risultati ottenuti nella determinazione secondo Rose-Gottlieb devono presentare una ripetibilità inferiore a o,05 g di grasso su 100 g di prodotto.

Con il metodo di Gerber la ripetibilità è correlata alla scala del butirrometro che presenta intervalli nella gradazione di 0,1 g di grasso su 100 g di prodotto. 

Il valore di materia grassa per legge non deve essere inferiore al 3,2% per il latte intero. Per il latte parzialmente scremato il valore è compreso tra l’1,0 e l’1,8%, mentre nel latte scremato il limite massimo è fissato allo 0,5%.

Tra i vari componenti del latte, il grasso è forse quello più soggetto a variazione di ordine sia qualitativo che quantitativo. Dal primo punto di vista le variazioni sono strettamente correlate al tipo di alimentazione del bestiame, mentre dal punto di vista quantitativo esse dipendono dalla razza, età, ora di mungitura, ecc.

Per quanto riguarda le determinazioni analitiche di composizione fine della materia grassa, si faccia riferimento al capitolo relativo alle analisi del burro.   

Scheda N°3.3_i: DETERMINAZIONE DEL TENORE IN LATTOSIO (METODO FEHLING)

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Reagenti

  • Acido acetico glaciale

  • Soluzioni A e B di Fehling

  • Soluzione al blu di metilene

 

Apparecchiatura

  • palloni tarati da 100 ml e da 250 ml

  • pipette da 10, 20 e 100 ml

  • buretta da 50 ml

  • bagnomaria

  • bunsen, treppiede e reticella

 

Procedimento

  • Prelevare 20ml di latte in un pallone tarato da 100 ml, aggiungere 20 ml di acqua distillata e 3 o 4 gocce di acido acetico glaciale

  • Tappare, agitare e porre a bagnomaria a 100°C per 10 minuti in modo da favorire la separazione delle proteine e della materia grassa dal siero contenente il lattosio

  • Raffreddare a 15 °C e portare a 100 ml con acqua distillata; agitare e filtrare raccogliendo il liquido (siero)

  • Con il siero (diluito 1: 5) riempire la buretta

  • In un pallone a fondo piano da 250 ml porre 5 ml di liquido di Fehling A, 5 ml di liquido di Fehling B, 40 ml di acqua distillata e un po’ di pietra pomice

  • Portare il tutto ad ebollizione vivace alla fiamma del bunsen. Raggiunta l’ebollizione si titola con il siero fino allo scoloramento del blu tipico del liquido di Fehling e la comparsa del colore rosso mattone (circa 6 – 6,5 ml di siero) sempre all’ebollizione

  • Lasciare bollire ancora 3 minuti, aggiungere 3 gocce di blu di metilene e far bollire per altri 6 minuti fino alla ricomparsa del colore rosso mattone.

 

Calcoli

La % m/ m di lattosio monoidrato è data dalla relazione:

                                                                           

LATTOSIO MONOIDRATO ( g/100ml) =0,0676*100*5A

                                                     

A = ml di siero impiegati nella titolazione

5 = numero di diluizioni effettuate

0,0676 = g di lattosio monoidrato necessari per ridurre 10 ml di liquido di Fehling.

Scheda N°3.4_j: DETERMINAZIONE DEI CLORURI NEL LATTE

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La presenza di cloruri nel latte dipende da vari fattori (periodo di lattazione, stato di salute, ecc.), normalmente è 90-100 mg/100ml, espresso come NaCl normalmente 1,65 g/L. Un aumento dei cloruri indica latte adulterato per annacquamento e aggiunta di cloruro sodico per renderlo isotonico. 

 

  • Soluzione di AgNO3 0,1 N

 

  • Soluzione di cromato di potassio (indicatore)

Pesare 10 g di cromato di potassio e solubilizzarli in 100 mL di acqua

 

Procedimento

In un becker da 250 mL introdurre 50mL di latte e 100 mL di acqua, aggiungere 6-7 gocce di soluzione al punto 2 e titolate con la soluzione al punto 1 fino a colorazione bruna.

Calcolare la percentuale di cloruri nel latte con la relazione:

 

                             g/L cloruro di sodio  = a * 0,117

 

  a = mL di soluzione al punto 1

Scheda N°3.4_k: DETERMINAZIONE DEL CALCIO

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Principio del metodo

La procedura analitica consiste nella titolazione complessometrica degli ioni calcio mediante una soluzione acquosa del sale disodico dell’acidoetilendiamminotetracetico (EDTA) a valori di pH fortemente alcalini (pH = 12 - 13 ). Prima della titolazione latte viene trattato con acido tricloroacetico per coagulare la parte solida del latte e liberare calcio e magnesio come ione dissociato. Il punto equivalente nella titolazione viene rilevato mediante l’utilizzo di HSN noto come acido carboncalconico che forma, in presenza di ioni calcio, un complesso rosso che vira al blu al punto di equivalenza. Nelle condizioni di pH adottate per la titolazione dello ione calcio, gli ioni magnesio precipitano sotto forma di idrossido di magnesio che pertanto non interferiscono nella determinazione.

 

Strumenti

Buretta da 25 mL con suddivisioni di 0,05 mL.

 

Reagenti

  • Soluzione di EDTA 0,01 M

Essiccare per 2 ore a 80°C il sale disodico diidrato dell'EDTA (C10H14N2O8Na2∙2H2O); pesare 3,725 g di sale essiccato, sciogliere in acqua e portare al volume di 1000 mL in matraccio tarato. Conservare la soluzione di EDTA in bottiglia di polietilene e controllare la concentrazione periodicamente.

  • Soluzione di idrossido di potassio (KOH) 2 M

Sciogliere 112,2 g idrossido di potassio (KOH) in acqua e portare a volume in matraccio tarato da 1000 mL. Conservare in bottiglia di polietilene.

  • Soluzione di ione calcio di riferimento (0,01 M in ione calcio)

Essiccare circa 2 g di CaCO3 puro per 2 ore a 150°C, lasciare raffreddare a temperatura ambiente in essiccatore. Pesare 1,0010 g di CaCO3 essiccato in una beuta da 500 mL, inumidire con acqua, aggiungere goccia a goccia una soluzione di acido cloridrico (HCl) 4 mL/L finché il carbonato sia disciolto. Evitare un eccesso di acido. Addizionare 200 mL di acqua e far bollire per alcuni minuti per liberare la CO2 dalla soluzione. Raffreddare a temperatura ambiente, addizionare alcune gocce di indicatore rosso metile, aggiungere ammoniaca 3 M finché la soluzione ritorna di colore arancio. Trasferire quantitativamente la soluzione in un matraccio tarato da 1000 mL, portare a volume con acqua ed omogeneizzare.

  • Soluzione di ammoniaca 3 M

Prelevare 462 mL di ammoniaca concentrata (NH3 · H2O 6,5 M ) e diluire con acqua in matraccio tarato fino a 1000 mL.

  • Indicatore HSN (acido carboncalconico)

Miscelare accuratamente 0,200 g di HSN acido [2-idrossi-1-(idrossi-4-sulfo-1-naftilazo)-3-naftoico] (C21H14N2O7S 3H2O) e 100,000 g di sodio cloruro (NaCl).

 

Standardizzazione della soluzione di EDTA

Trasferire 20,0 mL esattamente misurati della soluzione diluita da analizzare in una beuta da 250 mL, diluire a 50 mL con acqua, addizionare 2 mL di soluzione di idrossido di potassio (KOH) 2M e circa 0,2 g di indicatore HSN. Agitare e titolare immediatamente con la soluzione di EDTA 0,01 M tramite buretta sotto continua agitazione. Titolare piuttosto rapidamente all'inizio e più lentamente verso la fine; il punto finale si raggiunge quando il colore cambia al blu netto.

 

Calcolo della concentrazione dell'EDTA:

 

CEDTA=CCaVCaVEDTA

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Preparazione del campione di latte

Prelavare 100 ml di latte e porli in un becher da 250 ml dotato di una grande barra di rotazione magnetica. Posizionare su un agitatore magnetico e aggiungere lentamente con una pipetta a bulbo 10 ml di acido tricloroacetico 25% p/v. Lasciare agire per 10 minuti. Separare il siero di latte chiarificato mediante filtrazione su carta. Prelevare 22 mL di siero chiarificato, corrispondenti a 20 mL di siero iniziale, e diluirli a 1000 mL con acqua in un matraccio tarato.

 

Determinazione

Trasferire 100,0 mL esattamente misurati della soluzione diluita di siero da analizzare in una beuta da 250 mL, addizionare 2 mL di soluzione di idrossido di potassio (KOH) 2M e circa 0,2 g di indicatore HSN. Agitare e titolare immediatamente con la soluzione di EDTA 0,01 M tramite buretta sotto continua agitazione. Titolare piuttosto rapidamente all'inizio e più lentamente verso la fine; il punto finale si raggiunge quando il colore cambia al blu netto.

 

mg/L(Ca)=50∙CEDTAVEDTAPA(Ca)VSIERO10-3

 

mg/L(Ca)=2,004∙106CEDTAVEDTAVSIERO
 

(nelle prima formula 50 è il fattore di diluizione che deriva dai 20 mL di siero riportati a 1000 mL, CxVxPA(Ca) sono i mg di calcio e Vsierox10-3 sono i litri di campione prelevato)

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