In biologia con Bacteria si indica un regno comprendente microrganismi unicellulari, procarioti le cui dimensioni sono solitamente dell'ordine di pochi micrometri.

​

Suddivisione e classificazione

I procarioti si distinguono in due gruppi principali: 

• archaea, batteri che vivono in situazioni di temperatura e pH molto inospitali ma possono essere trovati in tutti gli ambienti. 

• bacteria, batteri; ad esempio Coliformi, Lactobacilli, Stafilococchi...

 

Fra loro si distinguono per forma in 

• Bacilli: a forma di bastoncino, se si dispongono a coppia si chiamano diplobacilli, a catena si chiamano streptobacilli;

• Cocchi: sferici, se si dispongono a coppia si chiamano diplococchi, a catena si chiamano streptococchi, a grappolo si chiamano stafilococchi;

• Vibrioni: a virgola;

• Spirilli: a spirale;

 

Un'altra importante suddivisione è quella che li raggruppa secondo la temperatura alla quale possono moltiplicarsi:

• batteri criofili (0-25°C)

• batteri mesofili (20-45°C)

• batteri termofili (45-70°C)

 

Un’altra classificazione è basata sulla loro relazione rispetto a un organismo:

• batteri “saprofiti”: vivono su organismi animali e vegetali morti, contribuendo alla loro decomposizione.

• batteri “simbionti”: vivono all’interno di organismi viventi, con i quali possono instaurare una relazione  di: 

• batteri mutualistici: situazione in cui entrambi ottengono un vantaggio.

• batteri commensali: i batteri ottengono le sostanze nutritive dal loro ospite, senza però causargli né vantaggi né svantaggi.

• batteri parassitismo: i batteri causano danni più o meno gravi agli organismi in cui vivono, senza recare loro alcun vantaggio.

• Batteri patogeni, batteri che causano patologie e infezioni, si dividono in:

  • Patogeni facoltativi, non causano sempre malattia, dipende dall'individuo e dalla loro concentrazione

  • Patogeni obbligati, causano anche singolarmente l’insorgere di una malattia

 

Un’altra classificazione è basata sulla colorazione

• In base alla colorazione Gram: positivi o negativi.

 

Sulla nutrizione:

• In autotrofi o eterotrofi.

 

E sulla respirazione:

• In aerobi o anaerobi

 

I batteri sono responsabili del deterioramento di cibi come la carne, il vino, la verdura, il latte e i latticini. L’azione di questi microrganismi produce un’alterazione delle caratteristiche chimiche dell’alimento il quale, in alcuni casi, presenta una variazione dell’aspetto o del gusto, mentre in altri casi può rappresentare una grave forma di avvelenamento alimentare.

 

I batteri rivestono poi un ruolo fondamentale nella composizione e nella formazione del suolo, in quanto con la loro decomposizione del materiale organico, immettono nel terreno grandi quantità di sostanze nutritive che sono utilizzate dalle piante.

 

Alcuni microrganismi, tra cui alcune specie di funghi e di batteri sono in grado di interferire con i processi vitali di determinati ceppi batterici; queste sostanze sono chiamate antibiotici e possono uccidere i batteri o impedire ad essi di crescere e riprodursi. Nel nostro secolo hanno rivestito un ruolo importantissimo per la sconfitta di diverse malattie infettive.

​

Struttura della cellula batterica

​

• Citoplasma

Formato da un soluzione acquosa chiamata citosol e da diversi aggregati insolubili come  i ribosomi (nei quali vengono sintetizzati le proteine) e il nucleoide (che contiene il cromosoma batterico costituito da una molecola di DNA circolare)

 

• Membrana cellulare

La membrana cellulare ha una struttura a mosaico fluido, ovvero composta da un doppio strato fosfolipidico, nel quale sono immerse le proteine, che svolgono la gran parte delle funzioni tipiche della membrana. Le principali funzioni della membrana sono: barriera semipermeabile, piattaforma di supporto per enzimi della catena respiratoria e delle biosintesi dei fosfolipidi di membrana, dei polimeri della parete e del DNA.

 

• Parete cellulare

La parete cellulare presenta una struttura notevolmente diversa a seconda che si tratti di batteri Gram-positivi o Gram-negativi. Nei batteri Gram-negativi lo strato di peptidoglicano è piuttosto sottile, con uno spessore di circa 50-100 Ångström, mentre la maggioranza dei batteri Gram-positivi ha una parete cellulare relativamente spessa, circa 200-800 Ångström. Esternamente al peptidoglicano i batteri Gram-negativi hanno una membrana esterna di spessore di circa 75-100 Ångström detta capsula.

Il peptidoglicano è composto da una proteina complessa formata da un polimero di aminoglucidi e peptidi. Nei batteri Gram-positivi è disposto in molteplici strati, tanto da rappresentare dal 50% al 90% del materiale della parete cellulare, mentre nei batteri Gram-negativi vi sono uno o al massimo due strati di peptidoglicano, che costituiscono il 5%-20% della parete.

Membrana esterna (capsula)

Oltre al peptidoglicano, i batteri Gram negativi possiedono uno strato aggiuntivo, chiamato membrana esterna (ME). Pur trattandosi effettivamente di un doppio strato lipidico, esso non è costituito soltanto da fosfolipidi e proteine, come la membrana citoplasmatica, ma contiene anche polisaccaridi. I lipidi e i polisaccaridi sono strettamente legati tra loro a formare un complesso lipopolisaccaridico. A causa della presenza di questo complesso, la membrana esterna è frequentemente chiamata strato lipopolisaccaridico o semplicemente LPS. La porzione polisaccaridica consiste di due frazioni, il polisaccaride interno o core polisaccaridico e il polisaccaride esterno, chiamato anche polisaccaride O.

 

• Ciglia e flagelli

Le ciglia e i flagelli sono estensioni cellulari costituite da proteine contrattili che permettono al batterio di spostarsi, le ciglia mediante un moto flessuoso e i flagelli attraverso un moto ondulatorio. Possiamo distinguere gli uni dagli altri dal punto di vista quantitativo (sono quasi indistinguibili in base alla microstruttura), infatti è possibile trovare molte ciglia in un batterio mentre i flagelli sono presenti in numero ridotto. Non tutti i batteri ne sono provvisti. 

 

• I Pili

I pili sono piccole appendici diffuse sparse per tutta la superficie del batterio. Permettono a questo di aderire al substrato su cui vivono o alle cellule da cui ricavano nutrimento e protezione. I pili sessuali sono un particolare tipo di pili che permettono la coniugazione, un processo grazie alla quale i batteri si possono scambiare materiale genetico.

 

METODI PER LA RICERCA BATTERICA

 

Una “coltura pura” è costituita solo da una specie di microrganismo. La contaminazione delle colture è a rischio in quanto i microbi si trovano ovunque, sulla pelle, nell’aria e sulle superfici dei piani di lavoro. Le regole fondamentali delle tecniche di asetticità sono:

 

• usare terreni e attrezzature sterili;

• lavorare vicini alla fiamma bunsen;

• sollevare i coperchi delle piastre Petri solo parzialmente;

• tenere i tappi delle provette tra le dita e non appoggiati sul bancone;

• flambare il collo della superficie esterna delle provette prima e dopo il prelievo;

• arroventare le anse e gli aghi da inoculo alla fiamma per l’intera lunghezza dell’astina metallica, sia prima che dopo i prelievi;

• la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm;

• quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla in modo da poterla vedere facilmente;

• sterilizzare la vetreria e il materiale monouso usati, dopo sterilizzare la vetreria e il materiale monouso utilizzati dentro apposite buste autoclavabili;

• disinfettare il bancone di lavoro accuratamente;

• sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto;

 

TECNICHE DI STERILIZZAZIONE

La sterilizzazione è il trattamento termico, chimico e gassoso per eliminare ogni forma di vita. Può essere realizzata con:

• calore secco,

• calore umido,

• filtrazione,

 

CALORE SECCO

• Aria calda: la stufa a secco utilizza temperature molto alte e serve a sterilizzare la vetreria messa in contenitori metallici o ricoperta con carta di alluminio. I parametri d’uso della stufa sono: 160° per 60’, 150° per 120’, 140° per 180’.

• Flambatura: con la fiamma del bunsen si può sterilizzare la superficie esterna delle provette, o delle beute. La fiamma del bunsen esercita un’azione germicida nell’aria intorno alla fiamma per un raggio di circa 10 cm, creando una zona sterile.

• Arroventamento: alla fiamma del bunsen è anche possibile sterilizzare l’ansa o l’ago prima e dopo i prelievi. Pinze o spatole si sterilizzano dopo averle immerse in alcool e poi passate alla fiamma.

 

CALORE UMIDO

• tindalizzazione: la soluzione da sterilizzare viene esposta a vapore fluente ad una temperatura di 100°C con un trattamento ripetuto per 3 giorni. Il trattamento è indicato per terreni nei quali possono crescere spore le quali, sfuggite al primo riscaldamento, vengono eliminate con il secondo e il terzo.

• vapore sotto pressione: per questa tecnica si usa l’autoclave che unisce l’azione del calore alla pressione. Il potere di penetrazione del vapore acqueo nel substrato viene aumentato. La sterilizzazione viene effettuata di solito a 121° per 15’.

 

FILTRAZIONE

• filtri millipore: si utilizza per le sostanze che non possono essere sterilizzate a caldo (zuccheri, latte, vitamine), si usano filtri porosi di acetato di cellulosa, capaci di trattenere i batteri di grandezza superiore ai loro pori.

• membrane filtranti: per filtrare campioni liquidi, al fine di trattenere i batteri in esso presenti, si utilizzano opportune membrane con l’apposito apparato di filtrazione.

• cappa a flusso laminare: serve per eseguire al suo interno manipolazioni microbiologiche per eliminare la contaminazione dei prodotti, dell’operatore e dell’ambiente.

 

Possiamo scoprire che i microrganismi hanno la capacità di popolare qualsiasi ambiente e possiamo anche osservare i caratteri morfologici delle colonie che si sono sviluppate. L’onnipresenza dei microrganismi può essere messa in evidenza contaminando con diverse sostanze (acqua, latte, polpastrelli, aria, terriccio) piastre di Petri riempite con Nutrient agar per contatto diretto o per esposizione. Poiché il terreno Nutrient agar possiede i nutrienti capaci di far crescere un gran numero di microrganismi, la loro presenza in ambienti diversi sarà evidenziata dallo sviluppo di colonie visibili ad occhio nudo.

 

LA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI

​

ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSE TECNICHE DI SEMINA MATERIALI E STRUMENTI:

 

MATERIALI BIOLOGICI: Colture microbiche

 

TERRENI DI COLTURA: Terreni di coltura liofilizzati (Nutrient agar, TSA, TSB, Nutrient broth, Gelatina).

 

VETRERIA: piastre di Petri sterili, pipette graduate sterili, provettoni, provette, tamponi faringei sterili, spatole sterili, anse, aghi, cilindri.

 

STRUMENTI: Bilancia, autoclave, termostato, bunsen.

 

UTILIZZO DEI TERRENI DI COLTURA DISIDRATATI:

Solubilizzazione: pesare il terreno e porlo in una beuta e aggiungere la metà del volume di acqua distillata richiesta. Agitare per solubilizzare poi aggiungere l’acqua rimanente lavando le pareti della beuta. Utilizzare sempre beute di volume almeno 2 volte e mezzo quello della sospensione. Riscaldare per ottenere una completa solubilizzazione agitando continuamente fino ad arrivare all’ebollizione. La completa solubilizzazione dopo alcuni minuti di ebollizione è indicata dalla trasparenza della soluzione.

 

SEMINA IN TERRENO SOLIDO

Tecnica di trasferimento per striscio su piastra:

1. Operare in ambiente sterile, passare l’ansa alla fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di patina batterica da una piastra o da una provetta. Trasferire il materiale su una piastra sterile strisciando l’ansa con movimenti ampi a zig-zag senza incidere il terreno, non tornare sui punti già seminati. Sterilizzare l’ansa dopo l’uso. La crescita si manifesta con formazione di colonie confluenti e isolate presenti sulla superficie dell’agar.

2. Sempre operando in ambiente sterile, passare l’ansa alla fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di patina batterica. Trasferire il materiale su una piastra sterile strisciando l’ansa con movimenti a zig-zag senza incidere il terreno solo su metà piastra. Sterilizzare e raffreddare l’ansa, ruotare la piastra e riprendendo dal punto interrotto, strisciare l’altra metà della piastra; ripetere l’operazione un’altra volta in modo da ottenere tre strisci in tre diverse direzioni. La crescita si manifesta con formazione di colonie confluenti nella prima metà e isolate nella seconda metà della fila della piastra, presenti sulla superficie dell’agar.

3. Nel caso in cui si voglia ottenere una crescita compatta, si può effettuare lo striscio con tamponi sterili che vengono passati più volte e in più direzioni sul terreno. Immergere un tampone in un brodo e trasferire il materiale su una piastra sterile strisciando più volte sulla superficie. Ruotare la piastra e strisciare ancora; sterilizzare il tampone dopo l’uso. La crescita si manifesta con formazione di una patina più o meno omogenea.

 

Tecnica dello spatolamento in piastra: 

• Operando sotto una cappa sterile o accanto alla fiamma del bunsen, prelevare con una pipetta sterile 0,1 ml di brodocoltura e trasferirlo al centro di una piastra con agar nutrient. Con una spatola sterile distribuire l’inoculo sulla superficie dell‘agar ’ in tutte le direzioni. Rovesciare la piastra ed incubarla a 28°/32° per 24/48h. Deporre la spatola nell’apposito sacchetto per la sterilizzazione. La crescita si manifesta con lo sviluppo di una patina presente sulla superficie dell’agar.

 

Tecnica della inclusione o diffusione in piastra:

• Nell’inclusione usiamo pipette sterili graduate per trasferire volumi precisi di inoculi nelle piastre. Successivamente si riempie la piastra con terreno di coltura sterile mantenuto fuso a b.m. a 45°C. Se la sospensione da seminare è concentrata, si procede ad una diluizione. La crescita si manifesta con lo sviluppo di colonie isolate presenti sulla superficie dell’agar ma soprattutto in profondità.

 

Diluizione ed inclusione:

• Diluire la brodocoltura quando è particolarmente concentrata. Predisporre 4 piastre nelle quali verserete 1 ml di ogni diluizione preparata mettendo nella prima piastra l’inoculo concentrato (conc. 100). Versare il terreno sterile, mantenuto fuso a b.m., nelle piastre seminate, chiuderle e miscelare con un movimento rotatorio, lasciare solidificare. Le colonie crescono sia in superficie che in profondità e se la semina è stata fatta bene, le colonie saranno in progressiva diminuzione, di aspetto uniforme e più piccole dove il numero è maggiore. Contaminazione Bassa (+) Media (++) Alta (+++) Altissima (++++).

 

Tecnica di isolamento e striscio su “slant”: 

• Operare in ambiente sterile, passare l’ansa alla fiamma e, dopo averla raffreddata, prelevare un po’ di patina batterica da una piastra. Aprire e flambare la provetta, trasferire il materiale strisciando l’ansa con movimenti a zig-zag senza incidere il terreno partendo dal fondo della provetta. Sterilizzare l’ansa dopo l’uso. La crescita si manifesta attraverso la presenza di veli o patina di consistenza cremosa o secca.

 

Tecnica di trasferimento per striscio da slant a slant (o “becco di clarino”): 

• operando in ambiente sterile, passare l’ansa alla fiamma e raffreddarla. Impugnare le due provette con una mano, togliere i tappi e flambare l’imboccatura alla fiamma. Prelevare un po’ di patina batterica dalla prima provetta, trasferire il materiale strisciando l’ansa con movimenti a zig-zag senza incidere il terreno, partendo dal fondo della seconda provetta. Flambare e tappare le due provette. Sterilizzare l’ansa dopo l’uso. La crescita si manifesta attraverso la presenza di veli o patina di consistenza cremosa o secca.

 

Tecnica per infissione in agar o gelatina: 

• Si utilizza questa semina con un ago per inoculare terreni solidificati in provetta. L’ago consente di inserire le cellule lungo una linea verticale e in profondità, per permettere lo sviluppo dei batteri anaerobi e favorire l’osservazione di forme mobili che si diffondono a partire dalla linea dell’inoculo.

 

SEMINA IN TERRENO LIQUIDO

Tecnica di trasferimento da “slant” a brodo: 

• Disporre le provette con il ceppo di Escherichia Coli e il brodo sterile da seminare vicino alla fiamma. Sterilizzare e raffreddare l’ansa, togliere i tappi dalle provette e flambarle. Prelevare con l’ansa un po’ di patina batterica dallo slant, inserire l’ansa con l’inoculo nel brodo sterile e stemperare. Flambare e tappare le provette. Sterilizzare l’ansa dopo l’uso.

• ​

Tecnica di trasferimento mediante pipetta:

• Disporre le provette con l’inoculo in brodo e il brodo sterile da seminare vicino alla fiamma, togliere i tappi dalle provette e flambarle. Prelevare con una pipetta sterile 1 ml di inoculo dalla prima provetta e trasferirla nella seconda. Flambare e tappare le provette. Deporre la pipetta nell’ apposito sacchetto per la sterilizzazione. La crescita in brodo si evidenzia a occhio nudo attraverso: torbidamento del terreno; formazione di un sedimento sul fondo della provetta che agitato sale verso l’alto; formazione di fiocchi o granuli in sospensione. Incubare i terreni seminati insieme ad alcuni non seminari, come controllo, a 37° per 24/48h.

 

OSSERVAZIONE E IDENTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI

​

COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE

Possiamo osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione semplice. I coloranti usati in microbiologia sono sostanze organiche nelle quali sono presenti gruppi funzionali detti “cromofori”, associati alla produzione di colore. Si distinguono in coloranti basici (blu di metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi (nigrosina, fucsina acida). La colorazione aumenta il contrasto con l’ambiente rendendo più visibili le cellule. Poiché i batteri sono ricchi di acidi nucleici, si colorano molto bene con coloranti basici come il Blu di metilene.

 

COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM

Questa colorazione consente la suddivisione di tutti i batteri in due categorie: i Gram positivi e i Gram negativi.  La diversa colorazione che assumono i batteri con questa tecnica dipende dalle differenze esistenti nella loro parete cellulare. La parete dei Gram positivi è costituita in gran parte da uno spesso strato di peptidoglicano che non permette la decolorazione della cellula batterica (colorata precedentemente con il colorante basico cristal violetto) da parte del decolorante. I Gram positivi rimangono dunque colorati in violetto. I Gram negativi hanno una parete multistratificata che, per la sua composizione chimica, risulta permeabile all’agente decolorante. Questi batteri, dunque, si colorano con il colorante di contrasto, la Safranina, assumendo una colorazione rosa.

​

COLORAZIONE DI ZIEHL NEELSEN

Questa sfrutta il fatto che alcune forme batteriche siano più resistenti alla penetrazione del colorante e si decolorino con difficoltà una volta trattati con acidi ed o alcoli. La metodica prevede l’utilizzo di coloranti molto concentrati, l’utilizzo di mordenzanti, e l’esecuzione a caldo della colorazione. I Batteri acido resistenti tratteranno il primo colorante ed appariranno colorati in rosso, i restanti batteri appariranno blu o verdi.

​

IDENTIFICAZIONE

Per identificare un batterio, sono possibili o necessarie anche altre metodologie: 

prove di natura biochimica, quali:     

• La valutazione della capacità del microrganismo di metabolizzare particolari terreni;

• Di produrre particolari enzimi (es. catalasi, fosfatasi), oppure di ridurre od ossidare determinati componenti.

 

Prove di natura 

• immunoenzimatica (test ELISA)

• biomolecolare PCR, Real-time PCR, Multilocus Sequence Typing, DNA fingerprinting, Southern blot, Northern blot.